扇贝丝氨酸蛋白酶及其抑制剂基因的克隆与表达

论文摘要

扇贝是我国海水养殖的重要品种,但自1994年以来,养殖扇贝陆续爆发的大规模死亡,不但造成了巨大的经济损失,而且直接威胁到现有产业的生存和发展。引起扇贝大规模死亡原因是多方面的,其主要原因是养殖环境恶化、扇贝种质衰退和抗病力下降。因此,在积极调整产业结构、加强环境治理、开展扇贝病原及流行病学研究的同时,深入研究扇贝免疫防御机制,探讨提高机体抗病力的有效途径和方法,改良种质和培育抗病品系,无疑是解决目前困扰扇贝养殖业健康可持续发展的必经之路。丝氨酸蛋白酶及其抑制因子在无脊椎动物的免疫应答中起着核心作用,它们的协同作用不但直接导致免疫信号转导和级联放大,还可激活特异性防御体系,如黑化反应、血液凝结和抗菌肽的合成等。本研究采用大规模EST测序方法,结合cDNA末端快速扩增技术,直接从cDNA文库中分离、克隆了9个扇贝免疫相关的丝氨酸蛋白酶及其抑制剂基因的全长cDNA序列,应用Northern blotting和RT-PCR方法检测了这些基因的组织定位及在损伤和不同类型微生物感染下的表达规律。栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶基因CFPS1和CFPS2的cDNA全长分别为1211-bp和1152-bp,分别编码354和336个氨基酸,均为具有信号肽执行胞外功能的分泌蛋白。两个基因结构相似,在成熟肽中,氨基端的clip结构域（clip domain）都由37个氨基酸残基组成,六个形成二硫键的保守半胱氨酸的排列顺序与大环卫素的半胱氨酸排列顺序相似。羧基端是典型起催化作用的丝氨酸蛋白酶结构域（TrypSPc domain）,活性部位催化三联体（H、D、S）和六个形成二硫键的半胱氨酸非常保守。两个结构域之间通过连接区域相连。CFPS1和CFPS2都以酶原形式存在,以类似于胰蛋白酶原激活方式被特异性的蛋白水解酶切。应用Northern blotting方法检测CFPS1和CFPS2基因在不同组织或器官中的表达发现,两个基因都主要在血细胞中表达。用RT-PCR检测CFPS1和CFPS2基因在损伤、不同类型微生物感染后的表达显示,损伤和鳗弧菌感染可以诱导CFPS1基因的表达,在两种刺激后16小时,CFPS1基因表达明显升高; 同样鳗弧菌感染也可以诱导CFPS2基因的表达,感染16小时后,CFPS2基因的表达也明显升高,但溶壁微球菌和巴氏毕赤酵母感染对CFPS2基因的表达差异不显著。

论文目录

• 目录
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 前言
• 第一节 无脊椎动物免疫
• 1. 非己的识别（Recognition of non-self）
• 1.1 肽聚糖识别蛋白（peptidoglycan recognition proteins,PGRPs ）
• 1.2 硫酯蛋白（thioester—containing proteins,TEPs）
• 1.3 革兰氏阴性菌结合蛋白（Gram negative binding proteins,GNBPs）
• 1.4 清除受体（scavenger receptors,SCRs）
• 1.5 C型凝集素（C-type lectins,CTLs）
• 1.6 硫依赖型凝集素（galectins,GALEs）
• 1.7 Toll 样受体（Toll like receptor,TLRs）
• 2. 免疫信号的调整和放大（Signal modulation and amplification）
• 2.1 丝氨酸蛋白酶级联反应（Serine protease cascades）
• 2.2 免疫信号转导的途径（Signal transduction pathways）
• 3. 病原体的清除（Pathogen elimination）
• 3.1 物理屏障
• 3.2 细胞免疫
• 3.3 体液免疫
• 第二节 动物免疫系统中的丝氨酸蛋白酶及其抑制剂
• 1. 动物免疫系统中的丝氨酸蛋白酶
• 1.1 丝氨酸蛋白酶级联与补体系统
• 1.2 丝氨酸蛋白酶级联与血液凝结体系
• 1.3 丝氨酸蛋白酶级联与前酚氧化酶激活系统体系
• 1.4 丝氨酸蛋白酶级联与背腹发育和抗菌肽的合成
• 2. 动物免疫系统中的丝氨酸蛋白酶抑制剂
• 2.1 动物丝氨酸蛋白酶抑制剂的分类
• 2.2 丝氨酸蛋白酶抑制剂在无脊椎动物免疫体系中的作用
• 第三节 研究目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 第一节 材料
• 1. 样品及样品处理
• 1.1 构建CDNA 文库的样品及样品处理
• 1.2 应激实验的样品及样品处理
• 2. 主要化学试剂与仪器设备
• 2.1 主要化学试剂
• 2.2 主要仪器设备
• 第二节 方法
• 1. 扇贝总RNA 提取
• 1.1 注意事项:实验用品的预处理
• 1.2 扇贝总RNA 提取
• 2. CDNA 文库的构建及序列分析
• 2.1 CDNA 文库的构建
• 2.2 序列分析与目的基因片段的获得
• 3. RACE PCR 获得全长CDNA 序列
• 3.1 扇贝CDNA 模板第一链的合成
• 3.2 3 '-RACE 扩增
• 3.3 5 ' -RACE 扩增
• 4. 感受态细胞的制备、连接及转化
• 4.1 感受态细胞的制备
• 4.2 连接
• 4.3 转化
• 5. Northern 杂交
• 5.1 CDNA 探针制备
• 5.2 Northern blotting 分析
• 6. 目的基因的生物信息学分析
• 7. RT-PCR 检测目的基因的表达
• 第三章 扇贝丝氨酸蛋白酶及其抑制剂基因的克隆与表达
• 前言
• 第一节 栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶基因的克隆与表达
• 1. 栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶基因CFP51 的克隆与表达
• 1.1 栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶基因CFP51 全长CDNA 的克隆
• 1.2 栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶基因CFP51 的结构与同源性分析
• 1.3 栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶基因CFP51 的表达
• 2. 栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶基因CFP52 的克隆与表达
• 2.1 栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶基因CFP52 全长CDNA 的克隆
• 2.2 栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶基因CFP52 的结构与同源性分析
• 2.3 栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶基因CFP52 的表达
• 3. 讨论
• 3.1 栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶基因CFP51 和CFP52 的结构分析
• 3.2 栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶基因CFP51 和CFP52 的表达
• 第二节 海湾扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆与表达
• 1. 海湾扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因AISPI-1 的克隆与表达
• 1.1 海湾扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因AISPI-1 的全长CDNA 克隆
• 1.2 海湾扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因 AISPI-1 的结构与同源性分析
• 1.3 海湾扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因AISPI-1 的表达
• 2. 海湾扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因AISPI-2 和AISPI-3 的克隆与表达
• 2.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂基因AISPI-2 和AISPI-3 全长CDNA 的克隆
• 2.2 丝氨酸蛋白酶抑制剂基因AISPI-2 和AISPI-3 的结构与同源性分析
• 2.3 海湾扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因AISPI-2 和AISPI-3 的表达
• 第三节 栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆与表达
• 1. 栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因 CFPSI -1 和 CFPSI -2 的克隆与表达
• 1.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CFPSI-1 和CFPSI-2 全长CDNA 的克隆
• 1.2 丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CFPSI-1 和CFPSI-2 结构与同源性分析
• 1.3 栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CFPSI-1 和CFPSI-2 的表达
• 2. 栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CFPSI -3 和CFPSI -4 的克隆与表达
• 2.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CFPSI -3 和CFPSI -4 全长CDNA 的克隆
• 2.2 丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CFPSI-3 和CFPSI-4 结构与同源性分析
• 2.3 栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CFPSI-3 和CFPSI-4 的表达
• 3. 讨论
• 第四章 结论
• 1. 栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶基因CFP51 和CFP52
• 2. 栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CFPSI-1,CFPSI-2,CFPSI-3 和CFPSI-4
• 3. 海湾扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因AISPI-1,AISPI-2 和AISPI-3
• 参考文献
• 博士期间发表和完成的论文
• GenBank 注册的功能基因
• 致谢