苦荞MYB转录因子基因的克隆及转录激活功能鉴定

论文摘要

苦荞（Fagopyrum tataricum）又称鞑靼荞麦,属双子叶植物蓼科荞麦属一年生草本植物,是我国荞麦的主要栽培种之一,广泛分布于我国西南一些高寒、边远、干旱山区和少数民族聚居地。苦荞作为药食两用植物,除含有丰富的营养物质外,还富含具有药用和保健价值的类黄酮物质（主要成分为芦丁）。苦荞类黄酮的生物合成受代谢途径关键酶和转录因子的共同调节。作为植物转录因子家族之一的MYB转录因子,功能众多,除参与植物对环境因子和激素的应答,并对细胞分化、细胞周期、器官的形成以及叶片的形态建成均具有重要的调节作用外,对植物类黄酮代谢也具调控作用。本研究以苦荞为材料,对苦荞MYB转录因子基因进行克隆和序列分析,并对其转录激活功能进行初步鉴定,有助于加深对苦荞类黄酮生物合成调控的认识,为进一步通过分子育种培育高产类黄酮苦荞品种提供参考。主要研究结果如下：1.根据植物MYB转录因子保守结合域设计简并引物,采用同源克隆的方法,以苦荞花蕾cDNA为模板克隆得到三条保守片段。采用RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）法克隆得到三条MYB转录因子的cDNA序列：FtMYB1（JF313345）, FtMYB2（JF313347）和FtMYB3（JF313349）.同时参考金荞（Fagopyrum dibotrys） FdMYBP1（EF522147）序列设计引物得到第四条苦荞MYB转录因子的cDNA序列FtMYB-P（HQ214132）.对MYB基因编码的氨基酸序列分析表明：N端均含有两个重复的MYB结构域,为典型的R2R3型MYB转录因子,C端有一个推测的酸性激活域。进化树分析显示FtMYB1、FtMYB2和FtMYB-P与类黄酮代谢调控相关的MYB聚类。2.采用PCR法扩增得到苦荞上述四个MYB转录因子的DNA序列。序列分析表明：FtMYB1,FtMYB2和FtMYB3含有两个内含子,FtMYB-P含有一个内含子,均符合"GU-AG"型剪切序列特征。3.采用酵母单杂交技术验证四个苦荞MYB转录因子的转录激活活性。构建重组质粒pBridge-FtMYBl、pBridge-FtMYB2、pBridge-FtMYB3和pBridge-FtMYB-P,转入酵母菌AH109,转化子经SD营养缺陷培养基筛选,Whatman滤纸显色反应和β-半乳糖苷酶活性测定。结果显示,FtMYB1、FtMYB2和FtMYB-P滤纸显色反应呈阳性,β-半乳糖苷酶活性分别为29.37U、11.80U和28.10U,表明它们具有强弱不同的转录激活活性；而FtMYB3滤纸显色反应呈阴性,p-半乳糖苷酶活性仅为2.24U,初步推测FtMYB3转录活性非常微弱。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1. 植物类黄酮
• 2. 植物类黄酮的代谢调控
• 3. 植物MYB转录因子研究进展
• 3.1 MYB转录因子的结构特征与分类
• 3.2 MYB转录因子的功能
• 3.2.1 参与植物细胞的形态与模式建成
• 3.2.2 参与对植物激素和外界环境压力的应答
• 3.2.3 对类黄酮代谢途径的调控
• 4 苦荞类黄酮及其代谢
• 4.1 苦荞类黄酮
• 4.2 苦荞类黄酮的代谢
• 5 研究目的及意义
• 第二章 苦荞MYB转录因子基因的克隆及序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌株与载体
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 培养基
• 1.1.5 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 苦荞总RNA提取
• 1.2.2 制备第一链cDNA
• 1.2.3 MYB基因保守片段的克隆
• 1.2.4 RACE法扩增苦荞MYB基因3’端cDNA序列
• 1.2.5 RACE法扩增苦荞MYB基因5’端cDNA序列
• 1.2.6 苦荞MYB基因cDNA编码序列和DNA序列的克隆
• 1.2.7 苦荞MYB基因的生物信息学分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 苦荞MYB基因保守片段的克隆
• 2.2 RACE法扩增苦荞MYB基因cDNA序列
• 2.2.1 RACE扩增3’端未知序列
• 2.2.2 RACE扩增5’端未知序列
• 2.3 苦荞MYB基因cDNA编码序列和DNA序列的克隆
• 2.4 苦荞MYB基因的序列分析
• 2.4.1 MYB基因的序列特征和编码蛋白的结构预测
• 2.4.2 MYB基因编码蛋白的三维空间结构预测
• 2.4.3 MYB基因编码蛋白的序列比对与系统进化树构建
• 3. 讨论
• 3.1 苦荞MYB基因的系统进化树分析
• 3.2 苦荞MYB基因的内含子分析
• 3.3 功能分析
• 第三章 苦荞MYB转录因子转录激活功能的验证
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 所用菌株和载体
• 1.1.2 酵母培养基
• 1.1.3 酵母单杂交中所用的溶液及缓冲液
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物设计
• 1.2.2 酵母表达重组质粒的构建
• 1.2.3 重组质粒的大肠杆菌转化及菌落PCR鉴定
• 1.2.4 重组质粒的小量提取及酶切鉴定
• 1.2.5 酵母转化
• 1.2.6 β-半乳糖苷酶活性的滤纸分析
• 1.2.7 β-半乳糖苷酶活性的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 重组质粒的构建
• 2.2 重组质粒的酶切鉴定
• 2.3 重组质粒的测序分析
• 2.4 重组质粒的酵母转化
• 2.5 转化菌株β-半乳糖苷酶活性的滤纸分析
• 2.6 转化菌株β-半乳糖苷酶活性的测定
• 3 讨论
• 3.1 酵母单杂交技术
• 3.2 苦荞MYB转录因子的转录活性
• 3.3 展望
• 小结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 攻读学位期间发表在GenBank中登陆的基因序列