论文摘要
土壤是人类赖以生存和发展的基础,承担着来自环境中大约90%的污染物,目前人们对土壤质量的要求主要集中于农药残留,重金属污染和有机污染,对于土壤中病原微生物的研究关注不多。土壤中的病原微生物可以通过多种暴露途径与人体接触,从而危害人体健康。大肠杆菌和沙门氏菌是土壤中两类重要的病原微生物,但目前国内检测病原微生物主要采用传统的平板培养方法,其操作耗时耗力,往往需要5-6天才能完成,而且灵敏度比较低,假阳性数量较多。近几年,随着免疫学和分子生物学的发展,基于新技术的病原微生物检测方法也被建立起来,尤其是国外,已有部分快速检测试剂盒产品问世,而国内相关研究相对滞后。为建立一种有效的病原微生物定量检测方法,本研究采用MPN-PCR的方法来定量检测土壤中的病原微生物。该方法的关键思路在于利用了PCR方法快速准确的优势,取代了传统MPN方法中阳性结果的生化鉴定和血清学鉴定等步骤,从而减少了传统方法中的繁琐步骤,提高了检测效率。针对大肠杆菌和沙门氏菌的特异性基因分别设计了两对特异性引物,优化了PCR反应模板的制备,建立了一种定量检测病原微生物的方法,并对该方法的灵敏度进行了评估,最后,在该方法的基础上开发了定量检测试剂盒。最终结果如下：1、分别以大肠杆菌和沙门氏菌作为研究对象,对同一样品进行了MPN计数与平板菌落计数并对计数结果进行回归分析,建立了两者对数值之间的定量关系。大肠杆菌MPN计数与平板菌落计数回归方程为y=0.9566x, R2=0.994 1；沙门氏菌MPN计数与平板菌落计数回归方程为y=1.0144x,R2=0.9957。对两者回归系数进行方差分析显示极显著。使MPN计数法具有与平板菌落计数法一样的准确性,从而为病原微生物,甚至功能微生物的定量计数提供更为准确的结果。2、根据沙门氏菌的invA基因序列,采用沙门氏菌用的特异性引物invA-1和invA-2,引物扩增片段为284bp；根据大肠杆菌phoA基因序列,采用引物设计软件Primer 5.0进行设计引物,引物扩增片段为684bp。同时对三种PCR反应模板制备方法进行了比较,选用热裂解法作为PCR反应模板制备方法。利用灭菌土壤中添加纯菌实验评估了定量检测方法的灵敏度：大肠杆菌定量检测方法的灵敏度为25个/g土壤,沙门氏菌定量检测方法的灵敏度为250个/g土壤。3、在建立定量检测方法的基础上,成功研制MPN-PCR定量检测试剂盒,并对其进行了灵敏度和保存期的评估：大肠杆菌定量检测方法的灵敏度为25个/g土壤,沙门氏菌定量检测方法的灵敏度为250个/g土壤。有效期均为3个月。4、利用所开发的定量检测试剂盒,对张家港和北京的共13个土壤样品进行了大肠杆菌和沙门氏菌的定量检测,结果发现土壤中不存在沙门氏菌,有6个样品检测到大肠杆菌,数量分别为：350、500、950、700、800、1700个/g土壤。