论文摘要
木聚糖酶是一类可降解木聚糖的酶系。木聚糖（Xylan）是一类分子结构变化范围很大的多糖，其主链由D-木糖以β-1，4-糖苷键连接而成，侧链是由许多短的取代基，如L-阿拉伯糖残基、4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸残基、O-乙酰基等组成。木聚糖是自然界中仅次于纤维素的一类多糖，分布广泛，是一种重要的可再生资源。木聚糖酶是人类利用木聚糖的重要工具，它在造纸、食品、饲料、生物质转化以及果汁、酒类、咖啡、香料和色素生产等方面有着广泛的应用前景，已经引起越来越多研究者的重视。米曲霉（Aspergillus oryzae）在传统发酵食品中应用历史悠久，已被用于工业酶制剂的生产之中，且是美国FDA认可的安全微生物菌种。本论文通过初步筛选，确定米曲霉（Aspergillus oryzae Cohn，AS 3.4382）为最适合诱变菌种，并对其进行诱变，获得一株产木聚糖酶量较高且遗传稳定的突变菌株。对该突变菌株的产酶条件进行优化，利用双水相法研究了木聚糖酶提取纯化工艺，通过分析比较酶的产生和细胞生长的关系，确定了该菌株产酶的模式为同步合成型，并由此建立了该突变菌株的生长模型。试验结果如下：1．米曲霉的诱变。论文采用紫外诱变和亚硝酸诱变结合的方法对米曲霉进行菌种诱变。用刚果红平板染色法筛选突变菌株，根据死亡率确定最佳诱变条件为：菌悬液浓度为1.0×106个，亚硝酸诱变60s，紫外照射10s。经诱变处理后，获得3株酶活较高的诱变菌株，其中两株遗传性能稳定。本文选取酶活较高的一株作为后续研究的对象。2．突变菌株产酶条件的优化。本文采用单因素（one time one factor）实验确定产酶最优条件为：种龄72h，接种量5％，装液量50ml／250ml，转速150r／min，温度28℃，初始pH值为5.0，发酵周期3天。通过Plackett-Burman设计和响应面法（Response surface methodology，RSM）获得突变菌株的最佳培养基配方：麸皮，2％；酵母膏，1％；吐温80，0.25ml；磷酸氢二钾，2.6％；氯化钙，0.5％；硫酸镁，1％；硫酸亚铁，0.016％；硫酸锌，0.006％。3．利用双水相法提取木聚糖酶。本文利用双水相法对木聚糖酶粗酶进行提纯，确定最佳纯化条件为：PEG 8000、PEG 8000浓度为19％（w／w）、磷酸氢二钾浓度为13％（w／w）、氯化钠浓度为0（w／w），木聚糖酶提取量达到97.58％。4．木聚糖酶酶学性质的研究。木聚糖酶的最适反应温度为50℃，最适pH值为5.0，在4.0-6.5之间，酶活可保持在最高酶活的80％左右，此酶在酸性条件下较稳定。Co2+和Fe2+对酶有强烈的激活作用，而Fe3+和Ba2+酶活有一定的激活作用。除了Ca2+和Zn2+离子有较强烈的抑制作用外，Pb2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Li2+各离子也均有不同程度的抑制作用，但抑制程度都不大，其残余酶活性均在50％以上。测得该酶在各个温度下的半衰期分别为：50℃时为105min，55℃时为45min，60℃时为15min，4℃时约为33d。5．米曲霉生长模型的建立。本文通过比较米曲霉突变菌株的生长曲线和产酶曲线，确定此突变米曲霉菌株产酶是属于同步合成型，并对米曲霉的生长模型进行了探讨，得到数学模型式为N=139.3388／(1+28.7922e-0.0593（?）。此模型与实验数据有着较好的拟合性。菌体极限值为1.39×106个／ml，最大比生长速率为0.0593h-1，拐点时间值为56.661h。