WSSV和干露胁迫条件下脊尾白虾（Exopalamoncarin cauda）ferritin基因及热休克蛋白70基因表达特征

论文摘要

铁蛋白ferritin基因是机体生长及免疫相关的重要功能基因，它具有调节铁代谢平衡、抗氧化细胞保护以及肿瘤免疫治疗等多种复杂的生物学功能，铁蛋白的研究已成为当前生命科学领域研究的热点之一。热休克蛋白70是热休克蛋白家族中的重要成员，是甲壳动物最重要的应激蛋白之一。目前，关于铁蛋白和热休克蛋白70的研究主要集中在脊椎动物上，而对于无脊椎动物，尤其是甲壳动物的铁蛋白的研究相对较少。本实验以脊尾白虾为实验材料，克隆了脊尾白虾ferritin基因，进行了WSSV感染对ferritin基因表达分析，完成了干露胁迫对脊尾白虾成活率、ferritin基因及热休克蛋白70的表达影响，旨在认知脊尾白虾免疫特点和环境胁迫下脊尾白虾的应激反应。研究分为两部分：第一部分是以脊尾白虾为研究对象，利用RT-PCR以及RACE技术获得了总长度为755bp的脊尾白虾（Exopalamon carincauda） ferritin基因cDNA序列。该基因序列5′和3′的非编码区分别为112bp和146bp，开放阅读框497bp，推测编码169个氨基酸。预测蛋白分子量19.1kDa，等电点5.46，5′-非编码区有一个铁反应元件（iron response element，IRE），该基因命名为Ecfer基因。氨基酸序列比对发现与其他甲壳动物铁蛋白氨基酸序列同源性在64%-67%，与脊椎动物铁蛋白H链氨基酸序列同源性在53%-57%。利用Neighbor-joining构建系统进化树分析结果表明Ecfer基因氨基酸序列与无脊椎动物中的甲壳动物聚为一支。运用荧光定量RT-PCR研究分析Ecfer基因在组织中表达分布,以及经WSSV感染后血淋巴、肝胰腺中的表达变化情况。实验结果表明Ecfer在肝胰腺、卵巢、肌肉、鳃和血淋巴中均有分布，在肝胰腺中表达量最高，卵巢中表达量最低。注射WSSV后3h和6h,脊尾白虾肝胰腺和血淋巴铁蛋白基因表达较对照组都有显著上调（P<0.05），并具有显著的时间差异性。说明WSSV感染可显著上调Ecfer基因的表达，提示了Ecfer基因可能参与了脊尾白虾抵抗WSSV入侵的免疫反应,血淋巴在WSSV感染中表现得比肝脏更敏感。第二部分以脊尾白虾为实验动物，以C组（干燥低温）、CG组（干燥常温）、P组（湿润低温）和PG组（湿润常温）四个实验组和一个对照组D组进行为期12h的干露胁迫实验，记录12h各实验组成活率。应用实时定量PCR方法研究了不同干露胁迫条件对脊尾白虾血淋巴、肝胰腺及肌肉中ferritin基因和HSP70基因表达的影响。结果表明：（1）保持虾体湿润并用冰块降温的P组干露胁迫12h后成活率为75%，显著高于其他各实验组（P<0.05）。（2）干露胁迫能上调P组脊尾白虾血淋巴、肝胰腺和肌肉ferritin基因的表达，显著高于对照组（P<0.05），并且各组织ferritin基因表达的上调时间具有差异性，血淋巴最先上调。干露胁迫对C组、CG组和PG组脊尾白虾各组织ferritin基因表达具有下调作用，并显著低于对照组（P<0.05）。（3）干露胁迫能诱导脊尾白虾血淋巴、肝胰腺和肌肉HSP70基因的表达水平，显著高于对照组（P<0.05）。各组织hsp70基因表达的上调时间具有差异性，肝胰腺最先上调。C组、CG组和PG组在1.5h出现大幅度上调，显著高于P组（P<0.05），P组上调缓慢。这些结果表明：保持虾体湿润低温可显著提高干露胁迫12h后脊尾白虾的成活率，干露胁迫与ferritin基因和Hsp70基因有直接影响。在干露胁迫在耐受范围内，ferritin基因和Hsp70发挥抗氧化功能。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1.1 脊尾白虾养殖产业的发展现状
• 1.1.1 脊尾白虾分类地位及生物学性状
• 1.1.2 脊尾白虾养殖发展现状
• 1.2 甲壳动物的免疫系统
• 1.2.1 体液免疫
• 1.2.2 细胞免疫
• 1.3 铁蛋白
• 1.3.1 铁蛋白的结构
• 1.3.2 铁蛋白（ferritin）分类
• 1.3.3 铁蛋白的功能
• 1.4 环境因素与甲壳动物的关系
• 1.5 热休克蛋白 70
• 1.5.1 热休克蛋白 70 的结构
• 1.5.2 热休克蛋白 70 的功能
• 1.6 展望
• 第二章 脊尾白虾（Exopalamon carincauda）ferritin 基因克隆及表达分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 实验仪器
• 2.1.3 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 脊尾白虾总 RNA 提取
• 2.2.2 脊尾白虾 ferritin 基因中间片段 cDNA 的克隆
• 2.2.3 Ecfer 基因全长 cDNA 序列分析
• 2.2.4 Ecfer 基因多序列比对及系统进化树分析
• 2.2.5 Ecfer基因在脊尾白虾各组织中的表达分布及WSSV对其肝胰腺、血淋巴中表达变化量的影响
• 2.3 讨论
• 第三章 ferritin 基因和热休克蛋白 70 在脊尾白虾抗干露胁迫中的作用
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 药品试剂及实验仪器
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 脊尾白虾不同离水干露条件下 12h 的存活率
• 3.2.2 干露胁迫对脊尾白虾 ferritin 基因表达的影响
• 3.3 讨论
• 3.3.1 干露刺激对脊尾白虾成活率的影响
• 3.3.2 干露胁迫对脊尾白虾 ferritin 基因表达的影响
• 3.3.3 干露胁迫对脊尾白虾 HSP70 基因表达的影响
• 结论
• 参考文献
• 硕士在读期间论文发表情况及课题资助
• 致谢