猪乙型脑炎病毒的分离鉴定、致弱及间接ELISA检测方法的建立

论文摘要

乙型脑炎是由日本脑炎病毒引起的中枢神经系统损害的一种急性人畜共患病毒性脑炎。乙型脑炎病毒属于黄病毒科黄病毒属,与西尼罗病毒、登革热病毒同属。该病毒可通过蚊子的叮咬传播,三带喙库蚊是主要传播媒介。人类感染乙脑后,死亡率在20%-50%,疾病治愈后多数幸存者存在中枢神经系统后遗症。猪是JEV感染环节中重要的中间宿主、扩增宿主,乙脑病毒可以导致母猪繁殖障碍、公猪睾丸炎,造成养殖业重大经济损失。同时研究表明,猪流行性乙型脑炎与人流行性乙型脑炎密切相关,因此预防控制乙脑在猪群的流行不仅可以降低经济损失,也是防控人患乙脑的重要措施。因此本研究对于猪群中流行的乙脑病毒进行了分离与鉴定、对乙型脑炎病毒致弱毒株的分子生物学特征进行了研究；利用原核表达系统表达JEV的主要抗原蛋白E蛋白和ED Ⅲ蛋白,构建检测抗体的间接ELISA方法,并对2010年上海地区部分猪场的乙脑流行情况进行了血清流行病学调查,为了解此病在猪群中流行情况,了解强毒株的致弱原因及病毒相关毒力区域,为建立有效的流行病学检测方法提供一定依据。研究的主要内容主要如下：1.采用2日龄乳鼠脑内接毒和BHK-21细胞接毒方法,从2009年收集的疑似发病猪的血液和公猪精液中分离得到6株能在细胞上产生稳定细胞病变和引起小鼠神经症状的乙脑病毒。通过间接免疫荧光试验（IFA）及RT-PCR方法对上述6株病毒进行鉴定,并将其PrM基因与标准毒株进行比较分析。6株分离毒株间接免疫荧光反应呈现特异性荧光,与SA14-14-2株、北京-1株、P3株、Whe株PrM蛋白的核苷酸的同源性均在96%以上,尤其与疫苗株SA14-14-2的同源性最高,这进一步证实了分离的病毒确实为乙脑病毒,也验证了不同乙脑毒株间的PrM蛋白基因的保守性。2.利用Hela细胞对流行性乙型脑炎NJ08株进行传代致弱,对于NJ08株及传代后第50代次、100代次毒株,参考GenBank中乙脑病毒NJ08株的基因序列,利Primer5.0软件设计合成针对JEV C蛋白、PrM蛋白与E蛋白基因的特异性引物,对其进行RT-PCR扩增并测序鉴定。结果表明不同代次的C蛋白及PrM蛋白核苷酸及氨基酸序列的同源性达99%以上；而不同代次毒株的E蛋白核苷酸及氨基酸序列的保守性较差,50代次与100代次毒株E蛋白的核苷酸发生变异的区域集中于第1200-1280位间。其氨基酸序列改变的区域位于370aa-440aa间。从流行性乙型脑炎病毒E蛋白的三维结构分析,该区域位于E蛋白结构上的C端跨膜区前的近膜区,该区域的改变可能导致病毒毒力的降低。3.通过PCR扩增出了流行性乙型脑炎强毒NJ08株E蛋白基因序列,连接到载体pCold Ⅰ中,成功构建了E-pCold Ⅰ表达载体。将构建好的E-pColdⅠ、EDⅢ-PET-28a表达载体转化表达菌,在IPTG的诱导下进行了表达,经亲和层析柱纯化获得JEV E白及EDⅢ蛋白,纯化后的E蛋白的浓度为300μg/ml,ED Ⅲ蛋白的浓度达到480μg/ml.经Westen blot分析所表达的蛋白均可以与JEV阳性抗体发生反应。4.以纯化的重组E蛋白和ED Ⅲ蛋白分别作为包被抗原,通过优化各步反应条件,建立了检测JEV抗体的间接ELISA方法。针对EDⅢ蛋白,最终确定抗原最适包被浓度为0.625μg/ml,针对E蛋白的的抗原最适包被浓度为1.875μ g/m1,血清最佳稀释度均为1：40,阴阳性临界值判定标准分别为OD450nm=0.333,OD45onm=0.454.两种方法都具有良好的特异性、重复性,与商品化试剂盒也具有很高的符合率,可应用于猪群的流行性乙型脑炎的流行病学调查。5.以原核表达的JEV ED Ⅲ蛋白为包被抗原构建的间接ELISA方法,对2010年从上海地区收集414份猪血清样品进行检测,JEV抗体的阳性率为68.69%。其中成年猪的血清抗体阳性率高达90.14%,仔猪的血清抗体阳性率为37.50%。对4周龄至16周龄的仔猪抗体水平进行检测,发现抗体水平呈现先降低后升高的趋势。利用空斑减少试验对血清的病毒中和活性进行进一步检测,显示80%ELISA检测为阳性的血清具有较好的病毒中和能力。说明本文所构建的方法,能够比较真实的反应出猪群中和抗体的水平,对了解群体免疫力提供了真实可靠的数据。此方法可以应用到田间的血清流行病学调查,并为构建更为精准的ELISA检测方法提供了参考依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述 流行性乙型脑炎的研究进展
• 1 病毒的病原学特征
• 1.1 JEV生物学特征
• 1.2 JEV分子生物学特征
• 2 流行病学
• 2.1 乙脑流行情况
• 2.2 乙脑的流行特征
• 2.3 乙脑的基因分型
• 3 发病机理及症状
• 3.1 致病机制
• 3.2 临床症状
• 3.3 病理变化
• 4 乙型脑炎的诊断方法
• 4.1 病毒的分离
• 4.2 血清学诊断方法
• 4.3 分子生物学诊断方法
• 5. 乙型脑炎的防控
• 6. 乙型脑炎疫苗的研究进展
• 6.1 传统疫苗
• 6.2 新型疫苗
• 参考文献
• 第一章 流行性乙型脑炎病毒的分离与鉴定
• 摘要
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 病料的采集及处理
• 1.1.2 细胞株与主要试剂
• 1.1.3 仪器与设备
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 病毒分离
• 1.2.2 病毒的鉴定
• 1.3 试验结果
• 1.3.1 病毒的分离
• 1.3.2 间接免疫荧光
• 1.3.3 RT-PCR鉴定及序列分析结果
• 1.4 讨论
• Abstract
• 参考文献
• 第二章 流行性乙型脑炎强毒NJ08株结构基因在传代致弱过程中的变异研究
• 摘要
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 病毒、细胞和实验动物
• 2.1.2 菌种和质粒
• 2.1.3 工具酶与主要试剂
• 2.1.4 仪器与设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 病毒的传代致弱及毒力检测
• 2.2.2 引物的引物与合成
• 2.2.3 病毒结构基因的反转录反应及其扩增
• 2.2.4 PCR产物的回收
• 2.2.5 基因片段与PMD18-T载体的连接
• 2.2.6 连接产物的转化
• 2.2.7 重组质粒的鉴定
• 2.2.8 序列测定与比较分析
• 2.3 试验结果
• 2.3.1 毒株致弱及各代次毒株脑内接种乳鼠的毒力差异
• 2.3.2 结构基因的分段扩增
• 2.3.3 重组质粒的鉴定
• 2.3.4 C蛋白基因序列同源性分析
• 2.3.5 PrM蛋白基因同源性分析
• 2.3.6 E蛋白基因同源性分析
• 2.4 讨论
• Abstract
• 参考文献
• 第三章 乙型脑炎病毒重组E蛋白、EDⅢ蛋白的原核
• 摘要
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 菌种、质粒及病毒
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 仪器和设备
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 目的片段的扩增
• 3.2.2 PCR产物的回收
• 3.2.3 回收PCR产物和载体质粒的酶切处理
• 3.2.4 E基因片段与表达载体的连接
• 3.2.5 转化到大肠杆菌DH5α
• 3.2.6 重组质粒的鉴定
• 3.2.7 阳性重组质粒转化表达菌
• 3.2.8 目的蛋白的表达与纯化
• 3.2.9 重组E蛋白、EDⅢ蛋白Western blot分析
• 3.3 试验结果
• 3.3.1 RT-PCR及重组质粒的酶切鉴定
• 3.3.2 小量诱导表达
• 3.3.4 重组蛋白的纯化
• 3.3.5 Western blot鉴定
• 3.4 讨论
• Abstract
• 参考文献
• 第四章 检测乙型脑炎病毒抗体的间接ELISA方法的建立
• 摘要
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 主要仪器
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 间接ELISA方法各项参数的确定
• 4.2.2 判断标准的确定
• 4.2.3 特异性实验
• 4.2.4 重复性实验
• 4.2.5 ELISA检测方法的初步应用
• 4.3 试验结果
• 4.3.1 间接ELISA方法参数的确定
• 4.3.2 特异性试验
• 4.3.3 重复性试验
• 4.3.4 ELISA方法的初步应用
• 4.4 讨论
• Abstract
• 参考文献
• 第五章 2010年上海地区猪乙型脑炎血清流行病学调查及血清中和抗体水平的初步研究
• 摘要
• 5.1 试验材料
• 5.1.1 猪群血清
• 5.1.2 试剂
• 5.1.3 主要仪器
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 临床猪血清样品JEV抗体的检测
• 5.2.2 病毒的空斑形成试验
• 5.2.3 空白减少中和试验对血清中和抗体的检测
• 5.2.4 数据分析
• 5.3 试验结果
• 5.3.1 猪血清JEV抗体的检测
• 5.3.2 病毒毒力的检测
• 5.3.3 血清中和病毒能力的检测
• 5.3.4 血清中和抗体效价的检测
• 5.4 讨论
• Abstract
• 参考文献
• 全文总结
• 附录
• 致谢