转Bt+Sck双价基因抗虫棉的培育及其遗传稳定性研究

论文摘要

从1996年起，转Bt基因抗虫棉开始在美国、澳大利亚、中国等商业化推广利用，这对防治棉花当前主要害虫棉铃虫，减少化学杀虫剂的使用量等发挥了重大的作用。然而，广泛应用的Bt基因抗虫谱较窄，加之害虫日益产生的耐受性已成为棉花基因工程面临的主要问题。而且，现有商品化的抗虫棉均存在“前期抗性水平高，后期却明显下降”的现象，棉花生长的后期正值结铃高峰，棉铃虫的危害直接影响了棉花的产量。将两类或多类不同的抗虫基因同时导入同一植株，这样既可以延缓害虫对其产生抗性、延长转基因抗虫植物的使用寿命，又可以通过不同基因之间的互补作用提高转基因抗虫植物的抗虫范围和抗虫能力。我国培育的转Bt+CpTI双价基因抗虫棉花品种“SGK321”在延缓害虫抗（耐）性的产生、延长转基因抗虫棉花的使用寿命等方面起到重要作用。我们将具有不同抗虫机理的抗虫基因研Bt（CryIA（c））和Sck基因通过花粉管通道法导入陆地棉品种中，以拓宽棉花的抗虫谱，培育出后期抗虫性较高的抗虫棉新品种，为棉花的现代分子育种增添新的内容。周光宇等1983年提出了花粉管通道介导的遗传转化。国内通过花粉管通道法培育了很多转Bt基因抗虫棉品系，其中一些品系已培育成品种或杂交种，并已进行产业化开发。然而有关花粉管通道法转化机理的研究报道较少，研究花粉管通道法转基因抗虫棉外源基因的整合方式及拷贝数，对抗虫棉的深层次利用和进一步阐明花粉管通道法的机理都具有重要意义。1995年由LIU等首创并发展了热不对称交错PCR（TAIL-PCR，Thermal Asymmetric InterlacePCR）方法，对拟南芥中T-DNA整合位点的侧翼序列进行了扩增。我们以通过花粉管通道法获得的Bt+Sck双价基因棉转基因当代植株为材料，通过改进的TAIL-PCR方法扩增T-DNA插入位点左、右边界的侧翼序列，为今后进一步研究花粉管通道转化方法的机理奠定基础。本研究采用花粉管通道法，以苏棉16为受体进行遗传转化，获得了5株正常可育的转Bt+Sck双价基因棉花（301-5、305-5、312-5、314-4和332-2）。经分子生物学方法检测，证实双价基因已整合在棉花基因组中并正常表达。室内棉铃虫抗性生物测定表明，这5株转基因棉花在盛花期和铃期的棉铃虫死亡率都大于90％，在棉花生长的后期仍表现出对棉铃虫幼虫很高的毒杀作用；对转化当代植株自交后代用室内棉铃虫抗性生物测定和卡那霉素沾叶法进行鉴定，初步表明其抗性基因表现为一对显性基因的遗传分离规律。用抗虫性测定和分子检测对转Bt+Sck双价基因棉花（纯合株系312-5T2和332-2T2）的遗传和表达方面的特性进行了研究。根据它们与受体亲本苏棉16配制杂交组合F2的抗虫性和抗、感虫分离结果，推断并进一步确定312-5T2和332-2T2对棉铃虫的抗性符合一对显性基因的孟德尔经典遗传规律。转Bt+Sck双价基因抗虫棉纯系312-5T2和332-2T2等位性测验证明：312-5T2与R19、SGK321的抗虫基因整合位点不连锁，表现为15：1的自由组合比例；而抗虫基因在332-2T2与R19中的整合位点表现连锁，与SGK321的抗虫基因表现15：1的自由组合；而且这些抗虫基因间在杂合状态下，并没有产生共抑制现象而导致对棉铃虫抗性的下降。用PCR跟踪检测，NptⅡ、Bt、Sck三个外源基因在转Bt+Sck双价基因棉花基因组中完全连锁，表现为共分离：分子检测和抗虫性测定显示三个外源基因在五个连续世代植株基因组中均存在，都抗卡那霉素、高抗棉铃虫，而且各世代（T0到T4）抗虫性水平也相当，从而证明它们能稳定地遗传和表达。抗虫性表现特点表明，转Bt+Sck双价基因棉花在苗期、盛花期以及结铃期三个不同的生育时期都对棉铃虫幼虫具有很高的抗性，随着棉花的生长发育进程对棉铃虫的抗性有所下降，表现为生育前期高后期低的特点（苗期＞盛花期＞铃期）；但在棉花生长的后期转Bt+Sck双价基因棉花仍表现出对棉铃虫幼虫很高的毒杀作用；而SGK321抗虫棉品系却明显下降。同时对转基因植株Bt毒蛋白含量进行ELISA测定表明，Bt毒蛋白含量的变化规律与虫测结果基本一致。对苏棉16受体材料导入Bt+Sck基因T0代经过两代自交所产生的5个转基因T2纯系（301-5T2、305-5T2、312-5T2、314-4T2和332-2T2）进行研究，观察其形态性状、产量性状、抗虫性、纤维品质等几个方面，和受体苏棉16做比较，阐明外源基因导入对棉花农艺性状的影响。这些效应具体表现为：结铃性和抗虫性提高；叶型变小、叶色加深；株高相当；铃重、衣分降低，305-5T2和314-4T2的衣分显著低于苏棉16号的衣分；转基因纯系的纤维品质与受体苏棉16无显著差异；除305-5T2产量低于受体苏棉16外，其余纯系与受体品种苏棉16的皮棉产量持平。采用改进的TAIL-PCR方法从2个转基因棉花当代植株中成功扩增出T-DNA插入位点的侧翼序列，结果表明：2个植株中T-DNA侧翼序列均包含一段载体骨架序列；T-DNA插入区富含A，T碱基对，并且属于核基质结合区（bind to nuclear matrices）；T-DNA整合到棉花基因组后，其左、右边界均有缺失。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 本文所用主要缩略词
• 本研究的创新点
• 第一部分 文献综述
• 第一章 棉花抗虫基因工程研究进展
• 1 苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白的一般特性
• 1.1 苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因的分类
• 1.2 苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白的分子结构与功能
• 1.3 苏云金芽孢杆菌晶体蛋白的杀虫机理
• 2 Bt杀虫蛋白转基因植物
• 3 Bt抗虫棉的应用
• 4 Bt抗虫棉抗虫性的研究
• 4.1 Bt抗虫棉杀虫活性的时空性
• 4.2 影响转基因抗虫棉抗虫性的因素
• 4.3 转基因抗虫棉的抗虫性遗传及遗传稳定性
• 5 转Bt抗虫基因棉花的安全性问题
• 6 抗虫棉花研究展望
• 6.1 转多基因抗虫棉的培育
• 6.2 采用特异启动子调控外源抗虫基因在棉株体内的高效表达
• 6.3 修饰Bt基因,以改善Bt毒蛋白的杀虫效能
• 6.4 重视外源与内源抗虫系统间的协调性,加强现代基因工程与传统抗虫育种相结合
• 6.5 筛选广谱性抗虫基因,培育广谱性抗虫棉花
• 第二章 转基因植物中有关外源基因整合的研究现状
• 1 植物转化过程中外源基因进入植物细胞的机制
• 1.1 农杆菌介导法中T-DNA进入植物细胞核的机制
• 1.2 直接导入法中外源基因进入植物细胞的机制
• 1.3 种质系统转化法中外源基因进入植物细胞的机制
• 2 植物遗传转化过程中外源基因的整合研究
• 2.1 农杆菌介导植物转化过程中T-DNA整合过程的研究
• 2.2 直接导入和种质系统介导转化中外源基因在植物基因组中的整合研究
• 2.3 获得T-DNA或转座子插入旁邻序列的方法
• 3 外源基因整合、遗传稳定性与外源基因表达
• 3.1 关于外源基因的整合特性与外源基因表达
• 3.2 外源基因的遗传稳定性与外源基因表达
• 本研究的目的与意义
• 第二部分 研究报告
• 第三章 花粉管通道法获得Bt+Sck双价抗虫棉及转化机理初探
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 质粒的大量提取
• 1.2.2 陆地棉花粉管通道法的转化
• 1.2.3 卡那霉素筛选
• 1.2.4 对苗床筛选出的抗性植株进行PCR扩增
• 1.2.5 转基因棉株的室内抗虫性测定
• 1.2.6 转基因植株的Southern blot杂交分析
• 1.2.7 转基因当代植株叶片总RNA反转后以目的基因引物序列进行RT-PCR
• 1.2.8 转基因植株的Bt毒蛋白含量分析
• 1.2.9 TAIL-PCR法从转基因棉花DNA中扩增出插入位点的旁侧序列
• 2 结果与分析
• 2.1 转化植株的卡那霉素抗性筛选及PCR扩增结果
• 2.2 转基因植株的Southern blot杂交分析
• 2.3 转基因植株叶片总RNA反转后以目的基因引物序列进行RT-PCR
• 2.4 转基因植株的Bt毒蛋白含量分析
• 2.5 转基因棉株的室内抗虫性测定
• 2.6 转基因棉花中插入区域侧翼序列的克隆及测序
• 2.7 T-DNA插入区侧翼序列与GenBank database的比对
• 3 讨论
• 3.1 棉花的遗传转化
• 3.2 转基因抗虫棉中Bt毒蛋白的检测
• 3.3 启动子与抗虫棉的抗虫效果
• 3.4 TAIL-PCR方法扩增T-DNA插入位点的侧翼序列
• 第四章 转Bt+Sck双价抗虫棉的遗传和表达及其农艺性状分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 生物测试的昆虫
• 1.1.3 生化试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 抗虫性的生物测定方法
• 1.2.2 Bt和Sck抗虫基因在转基因棉花中的遗传稳定性检测的分子生物学方法
• 1.2.3 转Bt+Sck双价基因棉花抗虫性的遗传方式及与其它转基因抗虫棉抗虫基因遗传关系的测定方法
• 1.2.4 转Bt+Sck双价基因棉花各世代Bt毒蛋白含量的测定
• 1.2.5 转Bt+Sck双价基因棉花纯系的田间棉铃虫调查
• 1.2.6 转Bt+Sck双价基因棉花纯系重要农艺性状的考查
• 2 结果与分析
• 2.1 转Bt+Sck双价基因棉花对棉铃虫抗性的遗传方式
• 2.1.1 转Bt+Sck双价基因棉花自交后代的分离
• 2.1.2 转Bt+Sck双价基因棉花与原始受体苏棉16杂交组合的抗性分离
• 2.2.转Bt+Sck双价基因棉花与R19,SGK321抗性基因的遗传关系
• 1对棉铃虫抗性表现'>2.2.1 转Bt+Sck双价基因棉花与R19、SGK321抗虫棉杂交种F₁对棉铃虫抗性表现
• 2群体对棉铃虫的抗性分离'>2.2.2 转Bt+Sck双价基因棉花与R19、SGK321 F₂群体对棉铃虫的抗性分离
• 2.3 转Bt+Sck双价基因棉花的遗传稳定性
• 2.3.1 转Bt+Sck双价基因棉花中外源抗虫基因的遗传稳定性
• 2.3.2 转Bt+Sck双价基因棉花后代的Southern blot
• 2.3.3 转Bt+Sck双价基因棉花后代的RT-PCR
• 2.3.4 转Bt+Sck双价基因棉花不同世代抗虫性的遗传稳定性
• 2代纯系的Bt毒蛋白含量分析'>2.4 转Bt+Sck基因T₂代纯系的Bt毒蛋白含量分析
• 2代纯系的抗虫性测定'>2.5 转Bt+Sck基因T₂代纯系的抗虫性测定
• 2代纯系的田间棉铃虫调查'>2.6 转Bt+Sck基因T₂代纯系的田间棉铃虫调查
• 2.7 转Bt+Sck基因纯系重要农艺性状的考查
• 2.7.1 转Bt+Sck基因纯系与转基因受体苏棉16形态性状的比较
• 2.7.2 转Bt+Sck基因纯系及原始受体苏棉16重要农艺性状的调查结果
• 3 讨论
• 3.1 转Bt+Sck双价基因棉花的遗传分析
• 3.2 转Bt+Sck双价基因棉花的抗虫性与Bt毒蛋白含量的关系
• 3.3 Bt+Sck双价基因导入对受体品种农艺性状的影响
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 发表论文情况