酵母2-苯乙醇耐受性的研究和高产菌株的选育

论文摘要

2-苯乙醇（又称β-苯乙醇）是一种具有玫瑰花香的芳香醇,广泛应用于医药、食品、化妆品、烟草和日化用品等产业中,随着天然2-苯乙醇市场需求量的不断增加,利用酵母生物转化生产天然2-苯乙醇具有广阔的市场前景和应用价值。但2-苯乙醇对酵母的抑制作用是生物法合成2-苯乙醇的瓶颈之一,研究酵母对2-苯乙醇耐受性有可能使2-苯乙醇产量大幅提高。本课题通过对实验室保藏13株工业酵母菌株耐受性和转化生产2-苯乙醇的能力进行测定,筛选到一株2-苯乙醇高耐受性高产菌Saccharomyces cerevisiae CWY132并确定了检查和评价其2-苯乙醇耐受性的培养条件。用紫外诱变方法对酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae CWY132进行诱变育种,获得了10株2-苯乙醇耐受性菌株。对耐受性突变酵母菌株的2-苯乙醇耐受性与产量之间的关系进行了考察,其中CWY132-10菌株的耐受性和产量都较高,耐受性较原始菌株提高了50%,产量提高了9.1%。又通过紫外诱变、60Coγ射线、N+注入等诱变方法对CWY132-10菌株做了第二轮的诱变育种,筛选到一株CWY132-10-γ2,其2-苯乙醇耐受性达到3.5 g/L,比原始出发菌株提高了75%,产量提高了15.1%,L-苯丙氨酸摩尔转化率达到97%。对筛选到的高耐受性菌株CWY132-10-γ2的发酵培养基和培养条件运用均匀设计进行优化,使得2-苯乙醇产量达到3.9 g/L,较原始出发菌株CWY132提高了18%。在筛选2-苯乙醇高耐受性突变株的同时,考察了二倍体菌株Saccharomyces cerevisiae CWY132的ARO9基因在合成2-苯乙醇中的作用,结果发现其中的一个ARO9基因敲除后2-苯乙醇产量下降了12%。但仍有必要再敲除该二倍体菌株中的另外一个ARO9等位基因,详细研究ARO9基因在转化合成2-苯乙醇的重要作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 2-苯乙醇的合成方法
• 1.2 2-苯乙醇生化合成途径与基因工程育种的研究
• 1.3 影响酵母菌合成2-苯乙醇的各种因素
• 1.4 产物抑菌作用是酵母生物合成2-苯乙醇的瓶颈之一
• 1.5 酵母酒精耐受性机理的研究进展
• 1.6 诱变育种提高酵母2-苯乙醇耐受性
• 1.7 选题背景和意义
• 第二章 高耐受性高产2-苯乙醇酵母出发菌株的筛选
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂和器材
• 2.1.4 方法
• 2.1.4.1 实验室保藏菌株耐受性的考察方法
• 2.1.4.2 实验室保藏菌产量的快速检测方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 实验室保藏菌株耐受性的考察
• 2.2.2 实验室保藏菌产量的考察
• 2.3 诱变出发菌株的选择
• 第三章 S.cerevisiae CWY132菌株2—苯乙醇耐受性影响因素的考察
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 试剂和器材
• 3.1.4 方法
• 3.1.4.1 S.cerevisiae CWY132对2-苯乙醇耐受性的考察方法
• 3.1.4.2 S.cerevisiae CWY132对2-苯乙醇耐受性条件的摸索
• 3.2 结果:
• 3.2.1 S.cerevisiae CWY132对2-苯乙醇耐受性的考察
• 3.2.2 S.cerevisiae CWY132对2-苯乙醇耐受性条件的摸索
• 3.3 总结
• 第四章 诱变育种提高酵母2-苯乙醇耐受性和产量
• 4.1 第一轮诱变育种
• 4.1.1 材料和方法
• 4.1.1.1 菌株
• 4.1.1.2 培养基和培养条件
• 4.1.1.3 主要试剂和仪器
• 4.1.1.4 CWY132与GER紫外致死率曲线的制作
• 4.1.1.5 诱变处理及耐受性突变菌株的液体筛选方法
• 4.1.1.6 耐受性突变菌株的固体筛选方法
• 4.1.1.7 耐受性与2-苯乙醇产量关系的考察
• 4.1.2 结果与讨论
• 4.1.2.1 CWY132与GER紫外诱变致死曲线
• 4.1.2.2 耐受性突变菌株的固液体筛选结果
• 4.1.2.3 耐受性突变菌株的筛选
• 4.1.2.4 2-苯乙醇耐受性突变菌株的遗传稳定性
• 4.1.2.5 耐受性与2-苯乙醇产量关系的考察
• 4.1.3 总结
• 4.2 第二轮诱变育种
• 4.2.1 材料与方法
• 4.2.1.1 菌株
• 4.2.1.2 培养基和培养条件
• 4.2.1.3 第二轮紫外诱变
• 60Coγ射线诱变育种'>4.2.1.4⁶⁰Coγ射线诱变育种
• 4.2.1.5 离子束诱变育种
• 4.2.2 结果与讨论
• 4.2.2.1 第二轮紫外诱变结果
• 60Coγ射线诱变育种'>4.2.2.2⁶⁰Coγ射线诱变育种
• 4.2.2.3 离子束诱变育种
• 4.3 耐受性与2-苯乙醇产量关系的考察
• 4.4 诱变方法比较
• 第五章 利用均匀设计法优化发酵培养基
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 菌株
• 5.1.2 培养基及培养条件
• 5.1.3 分析方法
• 5.1.3.1 实验设计
• 5.1.3.2 产物检测
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 均匀设计方案及检测结果
• 5.2.2 试验数据的回归分析及验证实验
• 5.2.3 二因子交互作用
• 5.3 讨论
• 第六章 S.cerevisiae CWY132相关基因研究
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.1.1 菌株
• 6.1.1.2 培养基
• 6.1.1.3 质粒和引物
• 6.1.1.4 主要试剂和仪器
• 6.1.2 方法
• 6.1.2.1 PCR合成ARO9基因敲除片段
• 6.1.2.2 PCR产物纯化
• 6.1.2.3 酵母高效转化
• 6.1.2.4 转化子鉴定
• 6.1.2.5 电泳分析
• 6.1.2.6 ARO9基因缺失酵母CWY132转化合成2-苯乙醇能力的考察
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 酵母ARO9基因的敲除
• 6.2.2 △aro9菌株的验证
• 6.2.3 ARO9基因缺失酵母CWY132转化合成2-苯乙醇能力的考察结果
• 6.3 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录