本文主要研究内容
作者王茜（2019）在《大肠杆菌植酸酶appA的定向改造》一文中研究指出：植酸酶是一类能将植酸及植酸盐降解为肌醇和磷酸（或磷酸盐）的酶的统称。植酸即肌醇六磷酸（myo-Inositol hexakisphosphate,IP6）,是植物种子中磷元素的主要储存形式。植酸是植物性饲料中存在的主要抗营养因子之一,对金属离子、蛋白质等都具有螯合作用,从而影响动物对营养物质的吸收。同时,磷作为动物生长与繁殖必需的矿物因素之一,单胃动物因缺乏分解植酸所必需的酶而不能有效利用植酸磷。植酸酶作为一种重要的饲料添加剂可以解决上述问题。在饲料生产的制粒过程中,植酸酶需要经过高温加热,如何提高植酸酶的热稳定性成为研究热点。植酸酶主要在动物的消化系统内起作用,消化系统内存在大量的蛋白酶。对蛋白酶的敏感性是制约植酸酶商业化应用的重要因素。本研究通过基因工程手段对大肠杆菌植酸酶appA进行定向改造,提高了植酸酶appA的热稳定性及蛋白酶的耐受性,并初步探讨了植酸酶结构与功能的关系,获得以下主要结果:1、N-糖基化对植酸酶appA的影响N-糖基化是一种重要的蛋白翻译后修饰。在毕赤酵母中表达后,植酸酶存在N-糖基化修饰现象。通过序列分析及结构模拟后发现,植酸酶appA中有三个N-糖基化位点（N139、N204和N317）,分别位于α-螺旋、β-片层和无规则卷曲上。为研究N-糖基化修饰对大肠杆菌植酸酶appA酶学性质的影响,本研究设计了一系列N-糖基化植酸酶突变体基因并转入毕赤酵母中进行了表达与纯化,并对野生型植酸酶appA-WT与N-糖基化植酸酶突变体进行了酶学性质的研究与比较。结果表明:相对较稳定的N-糖基化植酸酶突变体appA-Mut5分子量约为60 kDa,酶活为3187 U/mg,Km=445μmol/L,Vmax=3654 U/mg。植酸酶突变体appA-Mut5最适pH值为4.5,与野生型植酸酶appA-WT的最适pH无明显区别,最适反应温度为65°C,比野生型植酸酶appA-WT的最适温度提高了5°C,Tm值提高约11°C。经75°C处理15 min后,野生型植酸酶appA-WT丧失89%的活性,而完全去除N-糖基化位点的植酸酶突变体appA-Mut3在此处理后完全失活,N-糖基化植酸酶突变体appA-Mut5则仍能保持43%的残余活性。N-糖基化植酸酶突变体appA-Mut5不仅具有良好的热稳定性,并且对蛋白酶的耐受性也高于野生型植酸酶appA-WT及其他植酸酶突变体。基于实验设计,N-糖基化植酸酶突变体appA-Mut5上共有八个潜在的N-糖基化位点。利用LC-MS/MS技术确认了植酸酶突变体appA-Mut5上的N-糖基化位点数目和每个N-糖基化位点上所连的糖链。LC-MS/MS质谱检测结果表明:植酸酶突变体appA-Mut5上的六个位点（N74、N139、N171、N204、N317、N349）为N-糖基化位点,每个N-糖基化位点表现出不同的N-糖基化程度且所连的糖链不同;而覆盖N258和N282这两个N-糖基化潜在位点的糖肽没有被检测到。以上结果表明:N-糖基化修饰具有不均一性且对植酸酶appA的稳定性有促进作用。同时,本研究也确定新引入的三个位点（N74、N171和N349）可被酵母识别从而进行N-糖基化修饰,为植酸酶的定向改造奠定了基础。2、合理设计提高植酸酶appA的胰蛋白酶耐受性前期研究表明,植酸酶appA对胃蛋白酶具有很好的耐受性,但对胰蛋白酶较为敏感。为提高大肠杆菌植酸酶appA的胰蛋白酶的耐受性,本研究采用基于结构的合理性策略选择位于loop区的六个易受胰蛋白酶攻击的作用位点（K74、K75、K180、R181、K183和K363）作为候选位点。通过结构模拟和氢键分析,确定在植酸酶appA上突变K74D、K75Q、K180N、R181N、K183S和K363N这六个位点,获得了植酸酶突变体appA-M6。结果表明,纯化后的appA-M6具有酶活为3262 U/mg,分子量约为52-55 kDa。与野生型植酸酶appA-WT相同,appA-M6的最适pH（4.5）和最适温度（60°C）不变。与野生型植酸酶appA-WT相比,appA-M6对胰蛋白酶的抗性显著增强,Tm值升高3.8°C。由于新的突变位点的引入,植酸酶appA中增加了新的氢键,导致植酸酶的柔韧性降低,从而提高了植酸酶胰蛋白酶的耐受性和热稳定性。3、多位点组合突变获得热稳定性好且具有良好蛋白酶耐受性的植酸酶为获得热稳定性好,又具有蛋白酶耐受性的植酸酶,基于前期的研究结果,我们设计并表达纯化了野生型植酸酶appA-WT和植酸酶突变体appA-M8、appA-M10、appA-M12、appA-M15和appA-M16,分别测定比较了它们的酶学性质。通过筛选,最终确定突变位点的最佳组合为:W46E、Q62W、A73P、K74N、K75Q、G76T、S146E、R159Y、P173S、K180N、R181N、K183S、N204C、Y255D、Q349N、K365N这十六个位点,获得酶学性质最佳的植酸酶突变体appA-M16。植酸酶突变体appA-M16经80°C处理25 min后仍有40%以上的剩余活性,而appA-WT完全失活。植酸酶突变体appA-M16不仅热稳定性较好,而且胰蛋白酶的耐受性也获得了改善。对植酸酶突变体appA-M16中的N-糖基化修饰进行了检测,质谱的检测结果证明:新引入的三个N-糖基化位点（N74、N171和N349）确实发生了N-糖基化修饰。与野生型植酸酶appA-WT相比,植酸酶突变体appA-M16结构发生了改变。由于引入了新的氢键和N-糖基化修饰,其结构的刚性增强,植酸酶的构象更加稳定,从而改善了植酸酶的热稳定性及蛋白酶的抗性。本研究通过组合突变及最优位点筛选成功获得了一个热稳定提高及耐胰蛋白酶的植酸酶突变体appA-M16,并探讨了植酸酶结构稳定的分子机理,为定向改造植酸酶提供了一定的理论基础,筛选出的植酸酶突变体菌株具有良好的应用前景。
Abstract
zhi suan mei shi yi lei neng jiang zhi suan ji zhi suan yan jiang jie wei ji chun he lin suan （huo lin suan yan ）de mei de tong chen 。zhi suan ji ji chun liu lin suan （myo-Inositol hexakisphosphate,IP6）,shi zhi wu chong zi zhong lin yuan su de zhu yao chu cun xing shi 。zhi suan shi zhi wu xing si liao zhong cun zai de zhu yao kang ying yang yin zi zhi yi ,dui jin shu li zi 、dan bai zhi deng dou ju you ao ge zuo yong ,cong er ying xiang dong wu dui ying yang wu zhi de xi shou 。tong shi ,lin zuo wei dong wu sheng chang yu fan shi bi xu de kuang wu yin su zhi yi ,chan wei dong wu yin que fa fen jie zhi suan suo bi xu de mei er bu neng you xiao li yong zhi suan lin 。zhi suan mei zuo wei yi chong chong yao de si liao tian jia ji ke yi jie jue shang shu wen ti 。zai si liao sheng chan de zhi li guo cheng zhong ,zhi suan mei xu yao jing guo gao wen jia re ,ru he di gao zhi suan mei de re wen ding xing cheng wei yan jiu re dian 。zhi suan mei zhu yao zai dong wu de xiao hua ji tong nei qi zuo yong ,xiao hua ji tong nei cun zai da liang de dan bai mei 。dui dan bai mei de min gan xing shi zhi yao zhi suan mei shang ye hua ying yong de chong yao yin su 。ben yan jiu tong guo ji yin gong cheng shou duan dui da chang gan jun zhi suan mei appAjin hang ding xiang gai zao ,di gao le zhi suan mei appAde re wen ding xing ji dan bai mei de nai shou xing ,bing chu bu tan tao le zhi suan mei jie gou yu gong neng de guan ji ,huo de yi xia zhu yao jie guo :1、N-tang ji hua dui zhi suan mei appAde ying xiang N-tang ji hua shi yi chong chong yao de dan bai fan yi hou xiu shi 。zai bi chi jiao mu zhong biao da hou ,zhi suan mei cun zai N-tang ji hua xiu shi xian xiang 。tong guo xu lie fen xi ji jie gou mo ni hou fa xian ,zhi suan mei appAzhong you san ge N-tang ji hua wei dian （N139、N204he N317）,fen bie wei yu α-luo xuan 、β-pian ceng he mo gui ze juan qu shang 。wei yan jiu N-tang ji hua xiu shi dui da chang gan jun zhi suan mei appAmei xue xing zhi de ying xiang ,ben yan jiu she ji le yi ji lie N-tang ji hua zhi suan mei tu bian ti ji yin bing zhuai ru bi chi jiao mu zhong jin hang le biao da yu chun hua ,bing dui ye sheng xing zhi suan mei appA-WTyu N-tang ji hua zhi suan mei tu bian ti jin hang le mei xue xing zhi de yan jiu yu bi jiao 。jie guo biao ming :xiang dui jiao wen ding de N-tang ji hua zhi suan mei tu bian ti appA-Mut5fen zi liang yao wei 60 kDa,mei huo wei 3187 U/mg,Km=445μmol/L,Vmax=3654 U/mg。zhi suan mei tu bian ti appA-Mut5zui kuo pHzhi wei 4.5,yu ye sheng xing zhi suan mei appA-WTde zui kuo pHmo ming xian ou bie ,zui kuo fan ying wen du wei 65°C,bi ye sheng xing zhi suan mei appA-WTde zui kuo wen du di gao le 5°C,Tmzhi di gao yao 11°C。jing 75°Cchu li 15 minhou ,ye sheng xing zhi suan mei appA-WTsang shi 89%de huo xing ,er wan quan qu chu N-tang ji hua wei dian de zhi suan mei tu bian ti appA-Mut3zai ci chu li hou wan quan shi huo ,N-tang ji hua zhi suan mei tu bian ti appA-Mut5ze reng neng bao chi 43%de can yu huo xing 。N-tang ji hua zhi suan mei tu bian ti appA-Mut5bu jin ju you liang hao de re wen ding xing ,bing ju dui dan bai mei de nai shou xing ye gao yu ye sheng xing zhi suan mei appA-WTji ji ta zhi suan mei tu bian ti 。ji yu shi yan she ji ,N-tang ji hua zhi suan mei tu bian ti appA-Mut5shang gong you ba ge qian zai de N-tang ji hua wei dian 。li yong LC-MS/MSji shu que ren le zhi suan mei tu bian ti appA-Mut5shang de N-tang ji hua wei dian shu mu he mei ge N-tang ji hua wei dian shang suo lian de tang lian 。LC-MS/MSzhi pu jian ce jie guo biao ming :zhi suan mei tu bian ti appA-Mut5shang de liu ge wei dian （N74、N139、N171、N204、N317、N349）wei N-tang ji hua wei dian ,mei ge N-tang ji hua wei dian biao xian chu bu tong de N-tang ji hua cheng du ju suo lian de tang lian bu tong ;er fu gai N258he N282zhe liang ge N-tang ji hua qian zai wei dian de tang tai mei you bei jian ce dao 。yi shang jie guo biao ming :N-tang ji hua xiu shi ju you bu jun yi xing ju dui zhi suan mei appAde wen ding xing you cu jin zuo yong 。tong shi ,ben yan jiu ye que ding xin yin ru de san ge wei dian （N74、N171he N349）ke bei jiao mu shi bie cong er jin hang N-tang ji hua xiu shi ,wei zhi suan mei de ding xiang gai zao dian ding le ji chu 。2、ge li she ji di gao zhi suan mei appAde yi dan bai mei nai shou xing qian ji yan jiu biao ming ,zhi suan mei appAdui wei dan bai mei ju you hen hao de nai shou xing ,dan dui yi dan bai mei jiao wei min gan 。wei di gao da chang gan jun zhi suan mei appAde yi dan bai mei de nai shou xing ,ben yan jiu cai yong ji yu jie gou de ge li xing ce lve shua ze wei yu loopou de liu ge yi shou yi dan bai mei gong ji de zuo yong wei dian （K74、K75、K180、R181、K183he K363）zuo wei hou shua wei dian 。tong guo jie gou mo ni he qing jian fen xi ,que ding zai zhi suan mei appAshang tu bian K74D、K75Q、K180N、R181N、K183She K363Nzhe liu ge wei dian ,huo de le zhi suan mei tu bian ti appA-M6。jie guo biao ming ,chun hua hou de appA-M6ju you mei huo wei 3262 U/mg,fen zi liang yao wei 52-55 kDa。yu ye sheng xing zhi suan mei appA-WTxiang tong ,appA-M6de zui kuo pH（4.5）he zui kuo wen du （60°C）bu bian 。yu ye sheng xing zhi suan mei appA-WTxiang bi ,appA-M6dui yi dan bai mei de kang xing xian zhe zeng jiang ,Tmzhi sheng gao 3.8°C。you yu xin de tu bian wei dian de yin ru ,zhi suan mei appAzhong zeng jia le xin de qing jian ,dao zhi zhi suan mei de rou ren xing jiang di ,cong er di gao le zhi suan mei yi dan bai mei de nai shou xing he re wen ding xing 。3、duo wei dian zu ge tu bian huo de re wen ding xing hao ju ju you liang hao dan bai mei nai shou xing de zhi suan mei wei huo de re wen ding xing hao ,you ju you dan bai mei nai shou xing de zhi suan mei ,ji yu qian ji de yan jiu jie guo ,wo men she ji bing biao da chun hua le ye sheng xing zhi suan mei appA-WThe zhi suan mei tu bian ti appA-M8、appA-M10、appA-M12、appA-M15he appA-M16,fen bie ce ding bi jiao le ta men de mei xue xing zhi 。tong guo shai shua ,zui zhong que ding tu bian wei dian de zui jia zu ge wei :W46E、Q62W、A73P、K74N、K75Q、G76T、S146E、R159Y、P173S、K180N、R181N、K183S、N204C、Y255D、Q349N、K365Nzhe shi liu ge wei dian ,huo de mei xue xing zhi zui jia de zhi suan mei tu bian ti appA-M16。zhi suan mei tu bian ti appA-M16jing 80°Cchu li 25 minhou reng you 40%yi shang de sheng yu huo xing ,er appA-WTwan quan shi huo 。zhi suan mei tu bian ti appA-M16bu jin re wen ding xing jiao hao ,er ju yi dan bai mei de nai shou xing ye huo de le gai shan 。dui zhi suan mei tu bian ti appA-M16zhong de N-tang ji hua xiu shi jin hang le jian ce ,zhi pu de jian ce jie guo zheng ming :xin yin ru de san ge N-tang ji hua wei dian （N74、N171he N349）que shi fa sheng le N-tang ji hua xiu shi 。yu ye sheng xing zhi suan mei appA-WTxiang bi ,zhi suan mei tu bian ti appA-M16jie gou fa sheng le gai bian 。you yu yin ru le xin de qing jian he N-tang ji hua xiu shi ,ji jie gou de gang xing zeng jiang ,zhi suan mei de gou xiang geng jia wen ding ,cong er gai shan le zhi suan mei de re wen ding xing ji dan bai mei de kang xing 。ben yan jiu tong guo zu ge tu bian ji zui you wei dian shai shua cheng gong huo de le yi ge re wen ding di gao ji nai yi dan bai mei de zhi suan mei tu bian ti appA-M16,bing tan tao le zhi suan mei jie gou wen ding de fen zi ji li ,wei ding xiang gai zao zhi suan mei di gong le yi ding de li lun ji chu ,shai shua chu de zhi suan mei tu bian ti jun zhu ju you liang hao de ying yong qian jing 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自山西大学的王茜，发表于刊物山西大学2019-11-12论文，是一篇关于植酸酶论文,糖基化论文,热稳定性论文,胰蛋白酶耐受性论文,毕赤酵母论文,山西大学2019-11-12论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自山西大学2019-11-12论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
标签：植酸酶论文; 糖基化论文; 热稳定性论文; 胰蛋白酶耐受性论文; 毕赤酵母论文; 山西大学2019-11-12论文;