抗安氏隐孢子虫高免卵黄抗体（IgY）制备及其免疫保护和交叉保护性分析

论文摘要

本研究以饱和蔗糖溶液漂浮法和和改良抗酸染色法对郑州市郊某牛场100份粪样进行了调查,结果发现两种不同形态的卵囊,其中一种平均大小为7.25μm×6.33μm,卵囊形状指数为1.22;另一种平均大小为3.32μm×3.16μm,形状指数为1.05。根据其形态结构等特点初步鉴定为微小隐孢子虫（C. parvum）和安氏隐孢子虫（C. andersoni）。对上述经初步鉴定的牛安氏隐孢子虫（C. andersoni）卵囊,利用巢式PCR方法成功扩增出2个隐孢子虫分离株18SrDNA的部分片段,然后用SspⅠ酶切该片段,酶切图谱显示酶切片段大小为450bp和396bp,证实了本次扩增的牛源隐孢子虫为C. andersoni。以饱和蔗糖溶液漂浮法收集上述牛安氏隐孢子虫、静止自沉、上清负压抽滤,以改进的Sheather’s蔗糖梯度离心法提纯卵囊,滤器滤过提纯,通过反复冻融和超声波处理制备颗粒性抗原,制备可溶性抗原,以弗氏完全和非完全佐剂制备免疫抗原,设定免疫程序,免疫开产健康母鸡。应用免疫抗原量梯度增加的免疫方法,取得了满意的抗体水平。颗粒性抗原组一免、二免抗原量分别为1×107个·只-1,1×107个·只-1,三免、四免抗原量均为1.5×107个·只-1,五免、六免抗原量均为2.5×107个·只-1,每次免疫间隔15～20d,共免6次。可溶性抗原组一免40μg·只-1,二免40μg·只-1,三免80μg·只-1,四免80μg·只-1,五免120μg·只-1,六免120μg·只-1,每次免疫间隔15～20d,共免6次。两个组母鸡免疫后卵黄抗体逐渐上升,在六免后15d,可溶性组卵黄抗体水平ELISA效价达到1:12800,峰值区域（1:12800～1:102400）持续12周左右;颗粒性组6免后45 d,卵黄抗体水平1:12800,其峰值区域（1:12800～1:51200）持续10周左右;卵黄抗体的消长趋势与血清抗体的基本一致,但血清抗体水平明显高于同期卵黄抗体水平。采用间接ELISA法对获得的卵黄抗体进行初步鉴定,其具有隐孢子虫属特异性。以水稀释-盐析法纯化本次实验获得的IgY抗体,经SDS-PAGE分析后,提纯后的IgY抗体,主要有2条蛋白条带,即68KD左右的重链,26KD左右的轻链。经Western-blotting分析,IgY抗体识别牛安氏隐孢子虫可溶性蛋白条带的分子量26KD和68KD。IgY抗体在65℃以下对活性无影响,70℃15 min后活性下降20%左右,75℃15 min,活性下降了80%左右,80℃15 min基本无活性。IgY在PH4～10时活性无明显变化,PH<3或>11时活性明显下降,具有良好的耐酸碱性。应用自然感染安氏隐孢子虫动物治疗试验研究了抗安氏隐孢子虫特异性卵黄抗体的治疗效果。结果表明:与阴性卵黄治疗对照组相比,高免卵黄治疗组可以减少安氏隐孢子虫的排出,降低排卵囊高峰期的OPG值。本次试验还研究了不同抗隐孢子虫高免卵黄对感染同种隐孢子虫动物的交叉保护作用。治疗结果显示:抗安氏隐孢子虫卵黄抗体和抗贝氏隐孢子虫卵黄抗体均对感染贝氏隐孢子虫的雏鸡有保护作用,降低了感染强度,卵囊转阴提前2～3d。抗贝氏隐孢子虫IgY治疗保护组和抗安氏高免卵黄大剂量和中剂量治疗组差异不大,较小剂量治疗组保护力要好。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 文献综述
• 1 隐孢子虫各发育阶段抗原成分分析
• 2 隐孢子虫病的感染特点和免疫特点
• 2.1 隐孢子虫病的感染特点
• 2.2 隐孢子虫病的免疫特点
• 3 隐孢子虫病的抗体治疗
• 3.1 抗隐孢子虫高免初乳
• 3.2 抗隐孢子虫高免血清
• 3.3 抗隐孢子虫卵黄抗体
• 3.4 抗隐孢子虫单克隆抗体
• 3.5 抗隐孢子虫核酸疫苗
• 4 结语
• 试验一 抗安氏隐孢子虫特异性卵黄抗体的制备与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 主要试剂
• 1.2 试剂配制
• 1.3 耗材及主要仪器
• 1.4 方法
• 1.5 IgY抗体的收集纯化与测定
• 1.6 IgY抗体的鉴定
• 2 结果
• 2.1 牛隐孢子虫的检查结果
• 2.2 牛隐孢子虫卵囊的PCR-RFLP鉴定
• 2.3 牛安氏隐孢子虫的收集与纯化
• 2.4 牛安氏隐孢子虫抗原的制备
• 2.5 检测抗隐孢子虫卵黄抗体间接ELISA方法的建立
• 2.6 鸡群的免疫效果
• 2.7 IgY抗体的纯化效果
• 2.8 IgY抗体的鉴定
• 3 结论与讨论
• 3.1 抗原不同制备方式及免疫程序对免疫效果的影响
• 3.2 抗体消长规律
• 3.3 卵黄抗体的免疫印迹反应与隐孢子虫抗原的多样性
• 3.4 卵黄抗体理化性质的稳定性
• 试验二 抗C.andersoni特异性卵黄抗体的动物感染治疗试验
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 各组排卵囊规律观察结果
• 2.2 临床症状的观察结果
• 3 结论与讨论
• 试验三 抗隐孢子虫特异性卵黄抗体的交叉保护试验
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 各组排卵囊规律观察结果
• 2.2 对体重增重的影响
• 2.3 存活率
• 3 结论与讨论
• 3.1 隐孢子虫病的免疫防治
• 3.2 隐孢子虫病的特异性高免卵黄防治
• 主要参考文献
• ABSTRACT