栝楼抗肿瘤蛋白的纯化及活性研究

论文摘要

栝楼（Trichosanthes kirilowii Maxim）为葫芦科栝楼属植物,在我国主要分布于山东、河南、山西、陕西、江苏、浙江、安徽、四川、云南等省市。主要以果实和根部入药,均是历史悠久的常用中药材。瓜蒌,中国药典载为栝楼的果实,主要用来治疗心、肺方面的疾病。天花粉则来源于栝楼的块根,主要用于中期引产,主要成分为天花粉蛋白。天花粉蛋白曾在20世纪70年代在我国被广泛使用,但由于其在临床上容易引起发热、休克甚至死亡等过敏性反应,目前临床上很少使用。国外一些学者研究发现天花粉蛋白是一种单链核糖体失活蛋白,具有抗病毒、抗肿瘤等活性,尤其对HIV具有很好的抑制效果,因此天花粉蛋白又逐渐引起了人们的关注,但其毒副作用同样限制了其临床使用。目前很多医药工作者开始转向于寻找新的具有较低毒副作用的核糖体失活蛋白。本研究从所收集到的不同种质资源的栝楼中成功的分离、纯化到一种核糖体失活蛋白—Trichosanthrip,并对其性质和抗肿瘤活性进行了研究,取得了如下结果:1.从14份不同居群栝楼的种子中,采用硫酸铵分级沉淀、阳离子交换色谱和葡聚糖凝胶过滤色谱成功的纯化到了Trichosanthrip,经测定其纯度高达96.6%,产率为1 mg/100g种仁。2.Trichosanthrip经胰酶降解后使用LC-MS/MS分析,发现Trichosanthrip为AAILTSS超级蛋白质家族的一种新蛋白质。此类蛋白质广泛存在于植物的种子中,是植物种子中的一种自我防卫物质,具有抗真菌、病毒、细菌等病原物及抗昆虫的活性。3.使用MALDI-TOF MS精确测定Trichosanthrip分子量为10964.717 D;Trichosanthrip具有很好的RNA N-糖苷酶活性和蛋白质生物合成抑制活性,对蛋白质生物合成的IC50为1.6 ng/ml。4.Trichosanthrip能体外抑制S180肿瘤细胞增殖,使S180G0/G1期细胞增加,S期细胞减少,导致其出现G0/G1期细胞阻滞现象,其对S180的IC50为19.91μg/mL。5.Trichosanthrip能明显的抑制接种S180昆明种小鼠体内肿瘤生长,在1.5mg/kg·d剂量下,抑瘤率可达91.36%;在最高剂量1.5 mg/kg·d下,Trichosanthrip对小鼠的体重、脾脏指数和胸腺指数几乎无影响,其体重和脏器指数与空白对照无明显变化;且Trichosanthrip对小鼠的急性毒性很小,LD50为103 mg/kg,且当剂量达到75 mg/kg时才表现出急性毒性,远远高于实体瘤抑制实验中的最大剂量。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第1章 文献综述
• 1 栝楼研究概况
• 1.1 栝楼植物形态特征及种质资源
• 1.1.1 栝楼植物形态特征
• 1.1.2 栝楼种质资源
• 1.2 栝楼的药用部位及药理作用
• 1.2.1 瓜蒌
• 1.2.2 瓜蒌子
• 1.2.3 天花粉
• 2 核糖体失活蛋白研究进展
• 2.1 核糖体失活蛋白的基本特征
• 2.1.1 核糖体失活蛋白的分类和分布
• 2.1.2 核糖体失活蛋白的结构
• 2.1.3 核糖体失活蛋白抑制蛋白质生物合成的机理
• 2.2 核糖体失活蛋白的酶学活性
• 2.2.1 多聚核苷酸:腺苷糖苷酶活性
• 2.2.2 RNA水解酶活性
• 2.2.3 超螺旋DNA的解螺旋活性
• 2.2.4 核糖体失活蛋白的离子通道活性
• 2.3 核糖体失活蛋白的主要生理功能
• 2.3.1 植物防御作用
• 2.3.2 调节植物细胞代谢
• 2.3.3 储存蛋白
• 2.4 核糖体失活蛋白的毒性
• 2.5 核糖体失活蛋白的应用
• 2.5.1 核糖体失活蛋白在农业上的应用
• 2.5.2 核糖体失活蛋白在医药上的应用
• 3 癌症的发生及治疗概况
• 3.1 癌症的发生概况
• 3.2 癌症的治疗概况
• 3.3 免疫毒素在抗肿瘤上的应用概况
• 4 问题与展望
• 第2章 栝楼中一种新核糖体失活蛋白的分离、纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 Trichosanthrip粗提取
• 1.2.2 CM-52阳离子交换层析
• 1.2.3 Sephadex G50凝胶过滤
• 1.2.4 15%SDS-PAGE
• 1.2.5 蛋白质浓度测定
• 2 结果与分析
• 2.1 Trichosanthrip的分离、纯化
• 2.2 15%SDS-PAGE
• 2.3 Trichosanthrip在纯化过程中的产率和纯度分析
• 3 结论与讨论
• 第3章 Trichosanthrip的鉴定及性质研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 胰酶降解的Trichosanthrip多肽的LC-MS/MS分析
• 1.2.2 Trichosanthrip分子量测定
• 1.2.3 rRNA N-糖苷酶活性
• 1.2.4 细胞外蛋白质生物合成抑制活性测定
• 2 结果与分析
• 2.1 胰酶降解的Trichosanthrip多肽的LC-MS/MS分析
• 2.2 Trichosanthrip分子量测定
• 2.3 rRNA N-糖苷酶活性
• 2.4 细胞外蛋白质生物合成抑制活性测定
• 3 结论与讨论
• 第4章 Trichosanthrip抗肿瘤活性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 S180肿瘤细胞悬浮液配制
• 1.2.2 Trichosanthrip体外对S180肿瘤细胞抑制作用
• 1.2.3 Trichosanthrip对S180细胞周期的影响
• 1.2.4 Trichosanthrip对小鼠的急性毒性测定
• 1.2.5 Trichosanthrip对S180小鼠体内抗肿瘤活性测定
• 2 结果与分析
• 2.1 Trichosanthrip体外对S180肿瘤细胞抑制作用
• 2.2 Trichosanthrip对S180细胞周期的影响
• 2.3 Trichosanthrip对小鼠的急性毒性
• 180小鼠实体瘤生长的抑制作用'>2.4 Trichosanthrip对S₁₈₀小鼠实体瘤生长的抑制作用
• 2.5 Trichosanthrip对昆明种小鼠脏器指数的影响
• 3 结论与讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录