拟南芥LEA家族基因AtABR在非生物胁迫中的功能研究

论文摘要

高等植物生长发育的过程中经常会受到非生物胁迫的影响,植物可以通过激活非生物信号传导途径表达特异蛋白产物,从而在一定程度上缓解胁迫压力。不同的非生物可以激活相似的信号通路,引起相似的细胞应答及基因表达。根椐基因产物的作用可将诱导表达的基因分为两种:功能基因和调节基因。LEA蛋白是生物体中广泛存在的一类与渗透调节有关的家族蛋白,该蛋白的编码基因在植物种子胚胎发育晚期表达量丰富,而且在环境胁迫如干旱、低温、盐胁迫、ABA、紫外辐射和NaHCO3等条件下LEA基因的表达量大量累积。目前已在拟南芥中发现了51个LEA蛋白。LEA蛋白与植物的抗逆性密切相关,是一种多功能的逆境蛋白,可以使高等植物在极端条件下维持正常的生命代谢活动,但是对其参与植物抗逆境胁迫的分子机制还未深入研究,对其结构和功能的了解尚不完善,且存在很多争议。本实验室获得AtABR（At3G02480）基因的T-DNA插入突变体SALK14534（1atabr）,经三引物法和基因表达检测获得突变体纯合子。通过对AtABR基因的生物信息学分析、组织化学定位、基因时空表达、基因诱导表达分析和非生物胁迫下的种子萌发及幼苗根长实验,初步研究该基因的功能,探索AtABR基因在非生物胁迫条件下的分子保护机制。实验结果如下:1.通过对AtABR基因及其编码蛋白的生物信息学分析,表明AtABR属于拟南芥LEA家族。对AtABR基因启动子区进行预测分析,表明AtABR启动子区存在多种顺式作用元件,可能受ABA、GA、干旱和高温的诱导调控,且在非生物胁迫环境中与代谢保护机制相关。2.采用三引物法在DNA水平上快速鉴定出T-DNA插入突变AtABR基因的纯合体。经基因表达检测从RNA水平验证目的基因AtABR表达已完全被沉默。3.半定量RT-PCR分析发现,AtABR基因在拟南芥的果荚和种子中表达量最高,花次之,在根、茎、叶中的表达则很弱,表明AtABR基因主要在拟南芥的生殖器官中表达,可能参与拟南芥生殖器官的生长发育。4.通过非生物胁迫对AtABR基因表达的影响研究,表明AtABR基因受ABA、NaCl、干旱的诱导表达,且不受高温、低温、过氧化氢、MeJa、GA等非生物胁迫的影响。此结果表明AtABR基因可能参与了ABA、NaCl、干旱诱导的信号代谢途径。5.通过非生物胁迫对atabr种子萌发的影响研究,表明在NaCl和甘露醇胁迫下atabr种子萌发率高于WT,说明atabr种子萌发对NaCl和甘露醇不敏感,而在ABA和干旱胁迫下atabr种子萌发率无显著差异。6.从非生物胁迫对根长的影响实验来看,在ABA、NaCl、甘露醇逆境胁迫下, atabr主根长度与WT主根相比无显著差异。同时对比逆境胁迫条件下14天的atabr与WT子叶,也无明显表型差异。说明AtABR基因不影响植株幼苗的生长发育。7.分析研究AtABR启动子的组织化学定位,结果表明GUS基因在成熟花药和果荚柱头中表达,而在根、茎、叶、花萼等其它部位无表达;AtABR启动子为组织特异性启动子。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩写题表
• 第一章 绪论
• 1.1 植物抵御非生物胁迫的内源性保护物质及其作用机制
• 1.1.1 甜菜碱
• 1.1.2 脯氨酸
• 1.1.3 晚期胚胎丰富蛋白
• 1.1.4 糖类物质
• 1.2 LEA 蛋白
• 1.2.1 LEA 蛋白的产生
• 1.2.2 植物LEA 蛋白的分类和结构
• 1.2.3 拟南芥LEA 基因及表达特性
• 1.2.4 LEA 蛋白分布
• 1.2.5 LEA 蛋白生理功能
• 1.3 LEA 基因表达的调控
• 1.3.1 逆境条件下ABA 依赖及ABA 非依赖基因的表达调控
• 1.3.2 ABA 依赖型基因的表达
• 1.3.3 ABA 诱导型基因的表达
• 1.3.4 ABA 非应答型基因的表达
• 1.4 本研究的目的与意义
• 第二章 AtABR 基因及启动子生物信息学分析
• 2.1 引言
• 2.2 AtABR 基因序列信息
• 2.3 LEA 蛋白家族进化树分析
• 2.4 基因定位与进化关系
• 2.5 AtABR 启动子序列分析
• 2.6 本章小结
• 第三章 atabr 突变体的筛选与检测
• 3.1 材料与试剂
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 植物DNA 提取
• 3.2.2 植物总RNA 提取
• 3.2.3 cDNA 第一链合成
• 3.2.4 三引物法检测T-DNA 插入突变
• 3.2.5 AtABR 基因转录水平检测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 突变体基因组水平的鉴定
• 3.3.2 突变体转录水平鉴定
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 第四章 AtABR 基因诱导表达及生理功能初步探索
• 4.1 材料与试剂
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验溶液
• 4.2 方法
• 4.2.1 拟南芥RNA 提取
• 4.2.2 拟南芥RNA 纯化
• 4.2.3 拟南芥cDNA 合成
• 4.2.4 拟南芥AtABR 基因时空表达谱分析
• 4.2.5 AtABR 基因诱导表达分析
• 4.2.6 不同胁迫处理对atabr 突变体种子萌发的影响
• 4.2.7 不同胁迫处理对atabr 突变体根长的影响
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 AtABR 基因的时空表达模式
• 4.3.2 非生物胁迫对AtABR 基因表达的影响
• 4.3.3 非生物胁迫对atabr 种子萌发的影响
• 4.3.4 非生物胁迫对幼苗根长的影响
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 第五章 载体构建与组织特异性分析
• 5.1 材料与仪器
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 质粒和菌种
• 5.1.3 酶与生化试剂
• 5.1.4 培养基和常用溶液配制
• 5.1.5 拟南芥转化植株的培养
• 5.2 方法
• 5.2.1 植物总RNA 与DNA 提取
• 5.2.2 AtABR 基因克隆和目的基因与pBI1300-35S 表达载体构建
• 5.2.3 AtABR 启动子克隆及与pBI101-GUS 表达载体构建
• 5.2.4 农杆菌转化拟南芥植株
• 5.3 结果
• 5.3.1 拟南芥总RNA 提取与检测
• 5.3.2 AtABR 基因克隆与表达载体构建
• 5.3.3 AtABR 启动子克隆及与pBI101-GUS 表达载体构建
• 5.3.4 AtABR 启动子组织特异性检测
• 5.4 讨论
• 5.5 本章小结
• 结论与展望
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 附件