纳米氧化锌颗粒诱导BEAS-2B细胞IL-8基因表达的机制

论文摘要

[研究背景]纳米颗粒是尺寸小于100 nm的人造颗粒物,具有广泛的用途。纳米金属氧化物（如纳米氧化锌）是目前世界上纳米产量吨位较高的纳米材料。纳米氧化锌颗粒（Zinc Oxide nanoparticles, ZnO-NPs）可通过呼吸道、皮肤、消化道等途径进入人体。志愿者吸入实验研究结果表明,ZnO-NPs可引起“金属烟雾热”；支气管灌洗液中炎症细胞介素水平如白细胞介素8（Interleukin 8, IL-8）以及中性粒细胞数目均较对照组明显升高。体外研究结果显示,ZnO-NPs可刺激人呼吸道上皮细胞产生过量的IL-8。呼吸道IL-8主要来源于上皮细胞,在介导外源性毒物所致各种肺脏疾病过程中起关键作用。目前,ZnO-NPs所致IL-8基因表达的机制尚不清楚。[研究目的]阐明国产ZnO-NPs（30 nm）对人支气管上皮细胞IL-8基因表达的影响；揭示纳米氧化锌颗粒诱导IL-8基因表达的分子生物学机制。[研究方法]以人支气管上皮细胞株（BEAS-2B）为体外模型。用MTT方法测定ZnO-NPs对细胞的损伤作用。用RT-PCR和ELISA方法分别测定ZnO-NPs对IL-8mRNA和蛋白表达水平的影响。使用转录抑制剂和表达突变IL-8基因促进子的BEAS-2B细胞株观察ZnO-NPs对IL-8基因转录的影响。利用IL-8 mRNA降解试验测定ZnO-NPs对转录后IL-8 mRNA稳定性的影响。利用胞噬作用抑制剂观察细胞吞噬作用在ZnO-NPs所致IL-8表达过程中的作用。此外,利用原子吸收光谱手段测定ZnO-NPs在培养液中的溶解水平。[研究结果]ZnO-NPs刺激可致细胞内IL-8 mRNA水平及培养液上清中IL-8蛋白含量明显升高,该作用呈时间（2 h-4 h）及剂量（1μg/cm2-4μg/cm2）依赖性（P=0.000）。用转录抑制剂放线菌素D （1μg/ml）预处理细胞30 min,可显著降低ZnO-NPs （4μg/cm2,2 h）对IL-8 mRNA表达的诱导作用（P=0.000）,表明ZnO-NPs在转录水平调控IL-8基因表达。利用可表达野生型、NFκ,B和C/EBPβ结合位点突变型IL-8促进子的BEAS-2B细胞株,观察到在表达突变IL-8促进子细胞内,ZnO-NPs （4μg/cm2,2 h）对IL-8转录活性的影响较在野生型细胞明显降低（P=0.000）,说明转录因子NFκB和C/EBPβ参与调节纳米氧化锌对IL-8基因转录的诱导过程。在用放线菌素D终止IL-8 mRNA合成的前提下,ZnO-NPs（4μg/m2）可明显减缓细胞内IL-8 mRNA的降解,表现为在不同作用时间点（1h,2h,4h）, ZnO-NPs处理组IL-8 mRNA水平均较相应对照组（无ZnO-NPs刺激）高（P值分别为0.021、0.002、0.001）,说明ZnO-NPs对IL-8 mRNA有稳定作用。用细胞松弛素B（10μg/ml）预处理细胞30 min,可明显降低ZnO-NPs（4μg／cm2,2 h）对IL-8 mRNA表达的诱导作用（抑制率为30.14%）（P=0.000）,提示部分ZnO-NPs可通过胞噬作用进入细胞进而诱导IL-8的表达。8μg/ml（相当于24孔培养板一孔内加入4μg/cm2 ZnO-NPs） ZnO-NPs在培养液中37℃温育2 h,有4.3%的ZnO-NPs溶解,培养液上清中锌离子的浓度为3.57μM。[结论]ZnO-NPs刺激可明显提高人支气管上皮细胞内IL-8 mRNA和蛋白的表达水平；转录因子NFKB和C/EBPβ在ZnO-NPs所致IL-8基因转录过程中起重要调节作用；ZnO-NPs对细胞内IL-8 mRNA具有稳定作用；部分ZnO-NPs可通过胞噬过程进入细胞诱导IL-8基因的表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 人支气管上皮细胞株及其培养
• 2.3 技术路线与实验方法
• 3 结果
• 3.1 ZnO-NPs对BEAS-2B细胞的损伤作用
• 3.2 ZnO-NPs刺激可增加BEAS-2BIL-8mRNA和蛋白表达水平
• 3.3 ZnO-NPs对BEAS-2B细胞内IL-8基因转录的影响
• 3.4 ZnO-NPs对IL-8 mRNA稳定性的影响
• 3.5 细胞吞噬作用对ZnO-NPs诱导IL-8表达的影响
• 3.6 ZnO-NPs在培养液中溶解水平
• 3.7 不同RT-PCR实验的扩增曲线和溶解曲线
• 4 讨论
• 5 结论
• 展望
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 个人简历
• 致谢