论文摘要
随着经济的发展和人们生活水平的提高,市场对柑橘鲜果的品质特别是人类健康需求相关的功能性品质提出更高的要求,需要进行不断的柑橘种质创新,尤其是特色品种或富含次生代谢产物品种的培育。色泽品质作为柑橘果实品质的一个重要方面,对果实感观和营养品质有着重要的影响。柑橘果实色泽突变体因富含具有抗氧化作用的类胡萝卜素而具有较高的营养保健价值,市场潜力巨大。琯溪蜜柚（Citrus grandis cv. Guanxi）作为我国栽培面积和产量最大的柚类品种,果实低糖、多汁、富含维生素C及大量其他营养元素,深受消费者的喜爱。蜜柚色泽突变体红肉及黄肉琯溪蜜柚是近年来发现的色泽变异品种,不仅果肉色泽鲜艳,特异积累类胡萝卜素而呈现了不同色泽,在鲜果市场吸引力大,价格优势明显,具有重要经济价值。同时,这些色泽突变体具有重要研究价值,自然发生的体细胞突变体为研究柑橘果实积累类胡萝卜素机理的理想实验材料。本研究以琯溪蜜柚及其红肉和黄肉突变体为主要研究材料,通过测定其类胡萝卜素种类和含量,并检测三个品种类胡萝卜素代谢途径及上游（甲基赤藓糖醇途径,MEP途径）关键基因的表达,探索色泽突变体相对于其野生型高积累类胡萝卜素的分子机理,主要研究结果如下：1. HPLC检测白肉琯溪蜜柚及其两个突变体5个发育时期、4层组织的类胡萝卜素种类及含量。发现类胡萝卜素积累模式在不同品种中呈现不同的动态变化,具有一定的组织特异性。成熟期的红肉琯溪蜜柚在汁胞和囊衣中积累高含量的番茄红素,黄肉琯溪蜜柚在汁胞中积累高含量的β-胡萝卜素,这是两种突变体果肉呈现鲜艳红色和黄色的原因。红肉琯溪蜜柚在花后120天显著积累番茄红素,而黄肉琯溪蜜柚β-胡萝卜素在果实发育过程中一直维持较高水平。2.荧光定量PCR分析白肉野生型及其突变体中类胡萝卜素代谢合成酶基因的表达特点。对13个类胡萝卜素合成酶基因及3个MEP途径基因分析表明,在果实发育至成熟的整个过程中,红肉琯溪蜜柚汁胞LCYe（番茄红素ε-环化酶）和LCYb（番茄红素β-环化酶）基因的表达量迅速降低。红肉突变体囊衣层中,类胡萝卜素代谢上游MEP途径的关键基因DXS、DXR在120DAF时的相对表达量高于野生型和黄肉突变体；这些数据暗示类胡萝卜素下游相关基因（主要是环化步骤LCYe和LCYb基因）的表达量下降可能是红肉琯溪蜜柚汁胞积累番茄红素的分子基础：囊衣中是代谢途径上游基因的上调表达的结果。黄肉琯溪蜜柚中,从基因表达数据分析来看,可能是类胡萝卜素下游的关键基因,如BCH和ZEP自幼果期表达量迅速下降而使其汁胞中大量积累β-胡萝卜素。3.克隆柚子不同色泽变异品种及其野生型类胡萝卜素代谢关键酶基因（限速酶PSY,环化步骤LCYe和LCYb基因）的cDNA序列,并进行比较分析。PSY基因序列与NCBI中收录的温州蜜柑（C. unshiu）、葡萄柚（C. paradisi）和甜橙（C. sinensis） complete CDS进行比对,发现后三者的序列高度一致,琯溪蜜柚与之比较不仅存在多个碱基差异位点,还有连续碱基’AATAAT’（430-435位置处）的不同；将白肉琯溪蜜柚与其两个突变体汁胞层中克隆得到的PSY基因序列进行比对（其中白肉野生型得到5个克隆；红肉突变体得到3个克隆；黄肉突变体得到5个克隆）,发现三者序列高度一致,不存在SNP位点及连续碱基的差异。LCYB2基因基因序列与葡萄柚和甜橙进行比较,发现甜橙与琯溪蜜柚的序列高度一致,葡萄柚与两者比较存在多个碱基差异位点；白肉琯溪蜜柚与其两个突变体汁胞层中克隆得到的LCYB2基因序列进行比较（其中白肉野生型得到5个克隆：红肉突变体得到5个克隆；黄肉突变体得到3克隆）,三者序列较为一致,但黄肉琯溪蜜柚中存在三个碱基（位置）的差异,分别是2340位置的T→A,2549位置处C→G,以及2645处的T→C的变异。LCYE基因序列与葡萄柚和甜橙比对,发现甜橙与琯溪蜜柚和葡萄柚的序列相比有一段连续14个碱基的缺失’TGTGTCGAATCAGG’（405-418位置处）,且三者之间存在个别碱基的差异：白肉琯溪蜜柚与其两个突变体汁胞层中克隆得到的LCYE基因序列进行比较（其中白肉野生型得到8个克隆;红肉突变体得到6个克隆：黄肉突变体得到8个克隆）,三者序列较为一致,只存在2个碱基的差异（分别是994位置处黄肉突变体中G→A变异以及1146处红肉突变体中一个T碱基的缺失）。色泽突变体在LCYB2及LCYE基因序列水平的差异为未来基因功能验证或遗传关联分析提供基础。