牛骨酶解制备血管紧张素转换酶抑制肽的研究

论文摘要

本文利用牛骨蛋白酶解制备血管紧张素转换酶抑制肽,在以下几个方面开展了研究：研究了牛骨软化过程中骨蛋白的变化及实验室制备牛骨粉的营养价值；通过对牛骨的水解发现碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶对牛骨的水解效果较好；研究了酶解条件对牛骨蛋白酶解动力学参数的影响,根据动力学试验得到：碱性蛋白酶作用于骨蛋白的最适温度为55℃、pH为12,此时Vmax为0.10824 g/L·min,Km为11.71892g/L；中性蛋白酶作用于骨蛋白的最适条件温度为45℃、pH为7,此时Vmax为0.04724 g/L·min,Km为14.35711g/L；胰蛋白酶作用于骨蛋白的最适温度为55℃、pH为9,此时Vmax为0.05073g/L·min,Km为4.31516g/L。从新鲜猪肺中提取了血管紧张素转换酶（ACE）的粗酶液,纯化后得到了比活力为5.21u的ACE酶液；通过水解度与ACE抑制率的关系研究发现不同蛋白酶水解的水解度与ACE抑制率的关系不同；在此基础上选用碱性蛋白酶作为酶解骨粉制备ACE抑制肽的工具酶,通过条件的优化得到的最适酶解参数为50℃、pH 10、底物浓度25%、E/S为0.4、酶解时间为3h。利用葡聚糖凝胶色谱测定A3h的分子量分布,发现该混合肽主要分为3个组分,其中组分111分子量小于1000Da,且半抑制浓度最小为0.561mg/ml,抑制活性较高；利用5000Da的中空纤维膜进行超滤,得到的小分子混合肽进行氨基酸分析等定性分析。通过ACE抑制活性消化稳定性实验和ACE抑制动力学研究发现该混合肽为真抑制型的竞争性抑制剂。收集已报道数据进行分析发现肽中疏水性氨基酸和芳香族氨基酸对其ACE抑制活性有较大影响；利用大孔树脂富集疏水性氨基酸,确定了操作条件以50mg/ml骨肽上样浓度为佳,100%乙醇洗脱得到的组分ACE抑制活性最高,其半抑制浓度（IC50）为0.45mg/ml,组分得率为24.59%；利用颗粒活性炭富集芳香族氨基酸,确定了30mg/ml上样浓度为佳,利用100%乙醇+5%乙酸洗脱得到的组分IC50为0.59mg/ml。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 绪论
• 1 畜禽骨的结构
• 2 畜禽骨的营养价值
• 3 牛骨蛋白的酶解利用
• 3.1 酶的选择
• 3.2 影响酶解的因素
• 3.2.1 酶解前的软化处理对牛骨蛋白的影响
• 3.2.2 pH的影响
• 3.2.3 酶解温度的影响
• 3.2.4 酶解时间的影响
• 3.2.5 底物浓度与最佳E/S比的影响
• 4 ACE抑制肽的研究
• 4.1 血管紧张素转化酶
• 4.2 ACE对血压的调节作用
• 4.3 ACE抑制肽的抑制机理
• 4.4 ACE抑制肽的结构与功能的关系
• 4.5 ACE抑制肽的制备方法
• 4.6 ACE抑制肽的分离纯化
• 4.7 国外ACE抑制肽的研究现状
• 4.8 国内降血压肽的研究现状
• 5 立题意义
• 6 主要研究内容
• 第二章 牛骨粉的制备及牛骨蛋白酶解特性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 原料
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 主要仪器与设备
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 骨粉制备工艺
• 1.2.2 骨粉酶解工艺
• 1.2.3 动力学试验设计
• 1.2.4 指标的测定
• 2 结果与讨论
• 2.1 软化处理对牛骨蛋白的影响
• 2.2 牛骨粉的营养成分测定
• 2.2.1 牛骨粉的主要成分
• 2.2.2 牛骨蛋白氨基酸分析
• 2.3 加热预处理对牛骨蛋白质溶出的影响
• 2.4 酶的筛选试验结果
• 2.4.1 酶活力的测定结果
• 2.4.2 蛋白酶种类对水解效果的影响
• 2.5 PH、温度对牛骨蛋白水解动力学参数的影响
• 2.5.1 pH对最大反应速度及米氏常数的影响
• 2.5.2 温度对最大反应速度及米式常数的影响
• 2.5.3 三种酶对骨蛋白酶动力学比较
• 3 结论与讨论
• 第三章 牛骨制备ACE抑制肽的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 原料
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 酶解工艺
• 1.2.2 不同酶对ACE抑制率的影响
• 1.2.3 碱性蛋白酶的酶解条件优化
• 1.2.4 ACE粗酶的提取
• 1.2.5 硫酸铵沉淀
• 1.2.6 指标的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 ACE酶提取及纯化结果
• 2.2 三种酶解液对ACE抑制率的影响
• 2.3 三种酶水解度与ACE抑制率的关系
• 2.4 碱性蛋白酶正交试验结果
• 2.4.1 正交试验分析结果
• 2.4.2 各因素水解度与ACE抑制率的关系
• 3 结论与讨论
• 第四章 骨肽的定性分析及ACE抑制机理探讨
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 原料
• 1.1.2 试剂与材料
• 1.1.3 主要设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 A3h的制备
• 1.2.2 骨肽分子量的测定
• 1.2.3 水解物的超滤处理
• 1.2.4 骨肽ACE抑制活性稳定性试验
• 1.2.5 ACE抑制动力学研究
• 1.2.6 指标的测定
• 2 结果分析
• 2.1 A3H的分子量分布测定结果
• 50的关系'>2.2 骨肽各峰分子量分布范围与IC₅₀的关系
• 2.3 各组分紫外扫描图谱
• 2.4 超滤处理对水解物抑制活性的影响
• 2.5 氨基酸分析
• 2.6 ACE抑制动力学研究
• 2.7 骨肽ACE抑制活性稳定性研究
• 3 结论与讨论
• 第五章 骨肽ACE抑制活性与疏水性关系研究及纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 原料
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 主要设备
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 骨肽的制备
• 1.2.2 DA201-C大孔树脂纯化
• 1.2.3 活性炭纯化
• 1.2.4 指标的测定
• 2 结果与讨论
• 50的关系'>2.1 氨基酸组成与IC₅₀的关系
• 50)的关系模型'>2.2 疏水性、芳香族氨基酸与其LG(1/IC₅₀)的关系模型
• 2.3 疏水性氨基酸的纯化
• 2.3.1 不同上样浓度对大孔树脂吸附量的影响
• 2.5 DA201-C大孔树脂分级洗脱
• 2.6 梯度洗脱组分氨基酸分析
• 2.7 芳香族氨基酸的纯化
• 2.7.1 活性炭的静态吸附实验
• 2.7.2 活性炭的洗脱
• 3 结论与讨论
• 全文总结和创新点
• 参考文献
• 致谢
• 附录