论文摘要
一氧化氮（nitric oxide，NO）合酶（nitric oxide synthase，NOS）／NO与神经细胞分化密切相关。二甲基精氨酸二甲胺水解酶（dimethylarginine dimethylaminohydrolase，DDAH）能特异性水解内源性NOS抑制物非对称二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginine，ADMA），上调NOS活性。DDAH广泛存在于各种细胞和心血管、神经系统组织中。目前认为其活性降低所致的ADMA代谢减少与多种心血管疾病的发生发展密切相关，是一个新的心血管疾病相关蛋白和药物防治靶点。新近研究发现，舌下运动神经损伤后DDAHmRNA的水平明显升高，同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）可显著降低神经细胞DDAH的表达和活性并增加ADMA的水平，提示DDAH可能与神经系统发育或某些神经系统疾病的发生发展密切相关。本论文将从分子细胞水平系统研究DDAH在神经细胞分化和凋亡中的作用，并探讨DDAH／ADMA通路是否介导3,4,5,6-四羟基（口山）酮和全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，atRA）的抗凋亡作用。主要研究工作如下：在神经生长因子（nerver growth factor，NGF）诱导PC12神经细胞分化的体外模型，利用基因转染技术沉默或过表达DDAH1基因，系统探讨DDAH1调节神经细胞分化的作用及分子机制。结果显示：NGF（50 ng／ml）能诱导神经细胞分化，增加NO水平、DDAH1、nNOS mRNA及蛋白表达，并呈时间依赖性；NGF降低DDAH2mRNA和蛋白表达；NGF对DDAH活性和ADMA水平无明显影响；L-NAME能抑制NGF诱导的神经细胞分化和NO水平，但不影响DDAH1及DDAH2的表达。沉默DDAH1可抑制NGF诱导的神经细胞分化及其标志性蛋白微管相关蛋白（microtubule-associatedprotein2，MAP2）的表达，同时抑制nNOS mRNA的表达；而过表达DDAH1诱导神经细胞分化，增加G0／G1期细胞百分比，增加nNOSmRNA的表达，L-NAME能抑制过表达DDAH1诱导的神经细胞分化。（口山）酮是普遍存在于植物中的一类多酚类化合物。具有强效的抗氧化、抗炎作用。某些（口山）酮单体对血管内皮功能的保护作用与升高DDAH活性从而降低内源性ADMA水平有关。3,4,5，6-四羟基（口山）酮是我校药学院药物化学系合成的新型（口山）酮单体化合物。我室前期工已证明，3,4,5,6-四羟基（口山）酮对缺血心肌及血管内皮具有保护作用，其机制与抑制氧化应激有关。基于Aβ所致神经细胞凋亡与氧化应激密切相关及3,4,5,6-四羟基（口山）酮具有抗氧化特性，本实验采用Aβ25-35诱导PC12神经细胞损伤建立阿尔茨海默病（Alzheimers disease，AD）的细胞模型，研究3,4,5,6-四羟基（口山）酮对Aβ25-35所致PC12细胞凋亡的保护作用，并探讨其机制是否与DDAH／ADMA途径有关。结果显示：10μM Aβ25-35与PC12神经细胞孵育48 h能显著增加细胞凋亡率；Aβ25-35处理PC12细胞3 h后逐渐增加ROS水平和caspase-3活性，抗氧化剂PDTC（5μM）或caspase-3活性抑制剂DEVD-CHO（100μM）能显著抑制Aβ25-35诱导的凋亡；（口山）酮（3，10或30μM）能显著抑制Aβ25-35诱导的细胞凋亡，ROS水平和caspase-3活性的增加。Aβ25-35处理PC12神经细胞6 h后能显著降低DDAH活性和增加ADMA水平，（口山）酮（3，10或30μM）能显著抑制Aβ25-35诱导的上述作用。ADMA浓度和时间依赖性的诱导细胞凋亡；ADMA（10μM）处理PC12细胞3 h后逐渐增加ROS水平和caspase-3活性，抗氧化剂PDTC（5μM）或caspase-3活性抑制剂DEVD-CHO（100μM）能显著抑制ADMA诱导的细胞凋亡。atRA在调控细胞生长、分化、凋亡等生命活动中起重要作用。atRA通过与维甲酸受体（retinoic acid receptor，RAR）和维甲类受体（retinoid X receptor，RXR）结合，从而启动一系列靶基因的转录。其中DDAH2的启动子区含有维甲酸反应元件。新近研究发现，在培养的内皮细胞atRA能上调DDAH2的表达。本研究将探讨CoCl2诱导的PC12神经细胞调亡是否涉及DDAH／ADMA通路及atRA是否通过上调DDAH2表达抑制CoCl2诱导的神经细胞凋亡。结果显示：125μM CoCl2与PC12神经细胞孵育48 h能显著增加细胞凋亡率；CoCl2处理PC12细胞3 h后逐渐增加ROS水平和caspase-3活性；atRA（0．1，1 or 10μM）能显著抑制CoCl2诱导的细胞凋亡、ROS水平与caspase-3的活性的增加；抗氧化剂PDTC（5μM）或caspase-3活性抑制剂DEVD-CHO（100μM）能显著抑制CoCl2诱导的凋亡。CoCl2处理PC12神经细胞6 h后能显著降低DDAH活性和增加ADMA水平；8 h或12 h后分别显著降低DDAH2 mRNA或蛋白的表达；atRA（0．1，1 or 10μM）可显著抑制CoCl2对DDAH活性、表达及ADMA水平的影响。在DDAH2基因被沉默的PC12神经细胞，atRA（0．1μM）不能抑制CoCl2诱导的细胞凋亡；CoCl2处理DDAH2基因被沉默的PC12神经细胞12 h后，atRA（0．1μM）不再抑制CoCl2对ROS水平、caspase-3活性和ADMA水平的影响。
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