DNA点阵杂交鉴定逆境应答的转录因子新基因

论文题目: DNA点阵杂交鉴定逆境应答的转录因子新基因

论文类型: 硕士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 武从庆

导师: 熊立仲

关键词: 水稻,转录因子,点阵技术,非生物逆境,差异表达

文献来源: 华中农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 干旱和高盐是严重影响作物生长发育及产量的环境胁迫因子。为了克服逆境对作物的产量和品质造成的威胁，第一步就是要找到参与逆境应答机制的基因进而探究基因之间的调控关系，最终获得对植物逆境应答机制更全面的理解。 尽管许多研究表明大量转录因子在植物的各种逆境应答和适应过程中发挥重要作用。然而，目前在水稻中鉴定出来的与逆境相关的转录因子数目还非常有限。本研究利用一种大规模研究基因表达的方法——DNA点阵杂交技术来研究水稻逆境相关的转录因子。 利用已有的水稻EST数据库、全长cDNA数据库以及水稻基因组注释数据库，运用生物信息学方法，我们发现在水稻中至少有2300多个可能的转录因子(其中一半以上有对应的表达序列)，对这些转录因子按基因家族进行分类。通过比较发现水稻和拟南芥的转录因子基因家族的分布在大体上很相似，但在少数几个基因家族的数量和比例上存在明显差异。 为鉴定参与逆境调控的新的转录因子，我们根据已得到的转录因子序列，优先选择有对应EST序列的转录因子设计特异引物，用PCR方法分离了753个预测为转录因子的特异片段并制作了DNA点阵膜。用干旱、盐和ABA胁迫处理下的水稻叶片总RNA做探针，与DNA点阵膜杂交，通过检测胁迫条件下基因表达的差异来鉴定逆境相关基因。点阵杂交分析表明，约80％的编码转录因子的基因在幼苗叶片中表达，并且苗期的水稻叶片中转录因子的表达没有基因家族上的偏好；在干旱、盐以及ABA胁迫处理下，一共发现18个转录因子在至少一个胁迫处理中呈上升表达，29个转录因子在至少一个胁迫处理中呈下降表达，表达差异的倍数从2.0到20.5倍不等，共涉及44个独立的水稻转录因子，其中的绝大多数基因尚未报道过受逆境诱导或抑制。 用Northern杂交对选取的5个差异表达的转录因子进行了验证和进一步的表达分析，这些转录因子表达水平的差异倍数从低(2—3倍)到中(4—6倍)到高(大于8倍)皆有覆盖。结果除验证了DNA点阵杂交结果的可靠性外，还提供了这5个转录因子更详细的胁迫处理后的表达信息。据此，对它们可能在逆境反应中发挥的作用以及参与的逆境反应途径进行了初步分析。 我们还对部分初步鉴定出的逆境相关转录因子基因进行了全长cDNA的分离，

论文目录:

摘要

Abstract

缩略词表

前言

1 文献综述

1.1 转录因子

1.1.1 转录因子的分类与功能

1.1.2 逆境相关的转录因子

1.1.2.1 AP2/EREBP类转录因子

1.1.2.2 MYB类转录因子

1.1.2.3 bZIP类转录因子

1.1.2.4 Zinc finger类转录因子

1.2 植物抗逆基因研究策略

1.3 植物功能基因组学中基因表达的研究

1.3.1 mRNA水平上的基因表达研究

1.3.1.1 以PCR为基础的技术方法

1.3.1.2 以测序为基础的高通量技术方法

1.3.1.3 以杂交为基础的高通量技术方法

1.3.1.4 基于大规模Real-time PCR的技术方法

1.3.2 蛋白质水平上的基因表达研究

2 研究的目的和意义

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

2.1 胁迫处理

2.1.1 叶片相对含水量的测定

2.2 水稻叶总RNA的提取与逆转录反应

2.3 转录因子DNA点阵膜的制作和杂交

2.3.1 水稻基因组内转录因子的生物信息学分析

2.3.2 水稻转录因子的分离

2.3.3 点膜

2.3.4 DNA点阵杂交分析

2.4 Northern分析

2.5 RT-PCR分离全长cDNA

结果与分析

1 水稻转录因子的分类

2 转录因子的分离

3 转录因子在水稻苗期的表达

4 胁迫处理后差异表达的转录因子

5 部分差异表达基因的Northern验证和分析

6 逆境应答基因的全长cDNA分离和生物信息学分析

6.1 TF01C06的全长cDNA序列分析

6.2 TF03G07的全长cDNA序列分析

讨论

1 水稻转录因子的总数预测和分类

2 水稻转录因子的苗期表达

3 差异表达的转录因子

4 cDNA点阵杂交和Northern杂交比较

5 关于本实验获得的差异表达基因的进一步研究和利用

参考文献

附录A

附录B

致谢

发布时间: 2006-12-12

参考文献

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