超氧化物增殖物受体激动剂对糖尿病肾病的治疗作用及机制研究

论文摘要

糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）最常见的慢性并发症,是DM致死致残的重要原因之一。由于生活水平的提高及生活方式的改变,DM发病率逐年提高,DN的患病人数也逐步增多。DM患者的DN发病率已达30%～50%,在西方国家,DN已占终末期肾疾病的80%。DN是DM的微血管病变之一,常见病史超过10年的患者.随着DM患者的日益增加,DN的预防和治疗成为重要的医学课题之一。目前有许多方法用于延缓DN的进展,包括严格的血糖、血压控制、使用血管紧张素转化酶抑制剂等,但是仍然有大量的DN患者进展至终末期肾病,因此急需有新的方法预防和延缓DN的进展。过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferatoractivated receptors,PPARs）是一种激素激活受体和转录因子。迄今,三种不同的PPAR亚型相继克隆并分别命名为PPARα、β、δ。现证实PPARs的配体包括了从工业化学试剂和人工合成药物到内源性脂肪酸等多种结构不同的化合物。这些配体能够诱导大量分子和细胞水平的变化,包括过氧化物酶体增殖、脂肪生成、β氧化增加和细胞周期的调节等。PPARs是调节脂质代谢、脂肪生成、胰岛素敏感、炎症反应、细胞生长和分化的重要因子。上世纪90年代分子生物学阐明胰岛素抵抗靶点在细胞核内的PPARγ,TZDs类化台物是胰岛素增敏剂,同时也是PPARγ的药理性配基,PPARγ的激活导致葡萄糖、脂代谢及信号转导途径中一些关键基因的表达改变。这些基因表达增高可扩大肝脏和其它组织胰岛素受体后的反应,并在胰岛素内分泌未增加的情况下提高血糖控制能力。如改善胰岛素抵抗、降低血糖和高胰岛素血症,改善脂质代谢紊乱和高血压,对1型糖尿病的微血管并发症有防治作用。目前研究发现,肾脏可表达PPARs所有亚型。近年来研究证实,在糖尿病和非糖尿病大鼠,PPARγ活化后具有降低血压,延缓肾动脉硬化,降低尿蛋白和血肌酐水平,以及逆转肾小球硬化和间质纤维化进程等作用.而PPARγ的配体噻唑烷二酮类（Thiazolidinedione,TZD）如罗格列酮、匹格列酮近来也被临床用于治疗具有胰岛素抵抗的2型糖尿病。PPARγ的配体被认为是高血压病、动脉粥样硬化、糖尿病肾病的潜在治疗药物。本研究第一部分旨在探讨PPARγ激动剂吡格列酮对于高糖环境下体外培养的肾小球系膜细胞外基质积聚和降解的作用,以探讨PPARγ对于糖尿病肾病的治疗作用。近年来许多研究表明,TZD激活过氧化物酶体增殖物激活受体后对肾脏具有保护作用。但是这类药物有一个重要的副作用,患者服用后会出现水钠潴留,体重增加,这成为临床应用该类药物最大的问题,是制约PPARγ激动剂临床应用的重要因素,亟待解决。目前发现了一系列内源性的硝基脂肪酸衍生物,它们可以作为PPARs的激动剂,在体内发挥重要作用。不饱和脂肪酸可以经酶和自身催化氧化反应转化为信号转导分子,如前列腺素、白三烯、异前列烷等,这些产物可以介导免疫反应、神经传导并且调节细胞生长。脂类参与细胞信号转导的基本途径是通过一氧化氮以及其他的氮氧化物来介导生物反应。一氧化氮与膜磷脂和脂蛋白中的自由基反应抑制了其过氧化物自由基的自身催化作用。氮氧化物、不饱和脂肪酸和脂质氧化物反应产生一系列脂肪酸氧化及硝基化产物。近来有研究发现亚油酸的硝基烷化产物（LNO2）在人类血液中的浓度足以介导生物反应。体外试验结果显示LNO2介导依赖cGMP的血管舒张,cGMP非依赖性的抑制嗜中性粒细胞脱颗粒、过氧化物形成及血小板活化。近来研究证明LNO2可以通过激活PPARs来介导细胞信号转。LNO2作为信号转导分子,可有以下作用:生理剂量下可以作为内源性的PPARs激动剂,可以在水性环境下分解形成一氧化氮,作为亲电子体激活其他的硝基脂肪酸参与细胞信号转导。油酸和亚油酸分别占全部红细胞脂肪酸含量18%、8%,油酸结构简单、含量丰富,它的硝基衍生物硝基油酸（OA-NO2）在人血液和尿液中的含量超过了其它的硝基脂肪酸衍生物衍生物,而且的OA-NO2对PPARs的机动能力也超过LNO2。本研究第二部分拟对其药理作用进行研究,期望能够找到一种更理想的临床用药,以更好治疗糖尿病及其并发症糖尿病肾病,并减轻其副作用。研究方法:（一）第一部分吡格列酮对糖尿病肾病肾脏纤维化的治疗作用及机制探讨1.细胞的培养及传代肾小球系膜细胞分离纯化与原代培养方法在文献的基础上加以改进1.1系膜细胞培养:每只培养瓶用1mll%明胶均匀的铺满瓶底,放入4℃冰箱中过夜,备用。肾脏肿瘤手术切除后远离病患部位的正常肾脏组织,水囊引产的胎儿肾,用剪刀把肾皮质剪成碎块,放入重叠的三层不锈钢筛网,成年肾脏的筛网孔径孔分别为100目,150目,200目。胎儿肾筛网分别为100目,200目,250目。在最上层筛网上用研磨棒轻碾肾皮质,同时用PBS冲洗使其滤入下层筛网。继续研磨并冲洗,使其滤入下层筛网。冲洗第三层筛网,并用无菌的吸管吸取少量,将其在显微镜下观察,若见去肾小囊的纯净小球达90%以上,即可将筛网放入无菌平皿,用PBS冲洗,收集这层筛网上的组织。将收集的组织移入无菌离心管,700rpm,10min。离心后,弃上清,加入V型胶原酶,充分消化15-20min,用完全培养基终止消化,700rpm,10min,离心弃上清,取沉淀混匀分散后置处理好的培养瓶中,加入培养基,轻轻吹打,使沉淀在培养瓶中分布均匀,放入37℃,5%CO2孵箱中培养。1.2系膜细胞形态学观察:12-24小时后,肾小球即可贴壁,并且有单细胞以此为中心向外生长。第三天可将原代培养细胞取出观察,用PBS冲洗,去除未贴壁的细胞、细胞碎片,并更换培养液。第5-6天可见卵石样成团的细胞和梭状单个细胞夹杂生长。7-10天梭状细胞逐渐占优势,卵石样成团细胞逐渐减少。细胞长满后,可进行传代。1.3免疫荧光技术鉴定:利用甲醛固定细胞后,用0.3%H2O2甲醇灭活内源性过氧化氢酶,0.1%Triton x-100通透细胞,加入鼠抗人结蛋白,鼠抗人角蛋白,分别加入FITC标记单克隆抗体,温浴后,使用荧光显微镜观察并摄影,对系膜细胞进行鉴定。1.4 MTT法观察细胞生长状态:第四代细胞用胰蛋白酶消化为单层培养细胞,含20%胎牛血清的1640培养液配成单细胞悬液,按103-104/l接种于96孔培养板,细胞长满后,加入MTT20μl/孔,37℃继续孵育4h,终止培养,弃去上清,加入200μlSDS,孵育过夜,选择570nm在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值,观察成人肾脏和胎肾培养系膜细胞不同的生长状态,记录结果。2.葡萄糖及吡格列酮对肾小球系膜细胞PPARα、γ、σmRNA的检测2.1第2代细胞以1×108/l密度传入培养瓶,待细胞长至80%后,更换培养液（1640+0.5%胎牛血清）,饥饿24h,细胞分为4组,更换相应的培养基,分别为:5Mm/l D-glucose（normal glucose group,NG）,30Mm/l Dglucose（highglucose group,HG）,5mM/L D-glucose+25mM/lmannitol（osmotic control,mannitol group,MG）,5mM/l D-glucose+3μM/l pioglitazone（pioglitazone treatment group,PIO）处理24 h（实验中细胞均如此处理）。NG组、HG组、MG组、PIO组细胞分别培养24小时后。细胞用4℃的PBS（NaCL 8g;KCL 0.2g;Na2HPO4 1.15g:KH2PO4 0.2g,溶于1000ml蒸馏水中）洗涤1次,冰上负压抽尽液体,每盘细胞加Trizol0.5ml,一次性无菌刮匙轻轻刮下细胞,共变换3个90度方向,以免遗漏细胞。将刮下细胞收集到1.5ml EP管中,超声30sec,加氯仿和异丙醇,提取细胞总RNA。2.2逆转录（Reverse Transcription,RT）反应。冰上操作,按TakaraRNA PCR Kit要求操作。2.3实时定量PCR。按real-time PCR Kit要求操作。3.葡萄糖及吡格列酮对肾小球系膜细胞Ⅳ型胶原的影响3.1 NG、HG组、MG组、PIO组肾小球系膜细胞细胞分别培养24小时后,7.5%变性聚丙酰胺凝胶分离50μg细胞抽提总蛋白,以beta actin为蛋白对照进行定量比较。3.2免疫荧光检测葡萄糖及PPARγ激动剂对肾小球系膜细胞Ⅳ型胶原蛋白的影响4.PPARγ对机制金属蛋白酶平衡紊乱的调节作用（二）第二部分硝基油酸对糖尿病肾病的治疗作用及机制探讨1动物模型的构建1.1大鼠模型:ZDF大鼠是一种先天性糖尿病肾病模型,可以自发性的产生糖尿病及糖尿病肾病,一般6-8周会出现明显的血糖增高,12-14周会出现肾功能损伤,随着年龄增长,病变不断加重。12周ZDF大鼠分为2组,每组8只。二组大鼠在使用乙醚麻醉后,皮下埋植含硝基油酸（2μg/kg/d）微量泵。大鼠分别埋植含硝基油酸和PBS的微量泵,然后使用手术缝线缝合。微量泵共埋植28天,为防止硝基油酸部稳定14天时更换新的微量泵,重新埋植。微量泵埋植期间每7天采血一次,28天时,处死大鼠,同时采血,留取心脏肾脏组织。1.2小鼠模型的构建:1.2.1 LPS模型构建C57小鼠注射10mg/kg致死剂量LPS,观察小鼠生存率变化1.2.2盲肠结扎穿孔术（cecal ligation and puncture）C57小鼠使用乙醚麻醉后,皮下埋植含硝基油酸（200μg/kg/d）的微量泵。48h后打开腹腔,在盲肠末端1厘米处截扎,用20号针头在肠壁两端各扎一眼,挤出5毫米粪便,关闭腹腔。6小时后注射抗生素,后每12小时注射一次。24小时后处死动物,采集血液及肝脏肾脏组织。2血液、尿液及组织标本的采集2.1 ZDF大鼠血液及组织标本的采集:ZDF大鼠皮下埋植含硝基油酸的微量泵后每周自尾静脉采血1次,采血前一晚禁食,血液在采集2-3分钟内进行离心,分离红细胞和血清。4周处死大鼠。处死前,使用乙醚麻醉,自下腔静脉采血,然后处死。留取心脏和肾脏组织,组织放入液氮中保存。2.2尿液标本采集:ZDF大鼠放入代谢笼中,收集24小时尿。收集的尿液在低温离心机中以8000rpm离心5分钟,吸取上清,放入低温冰箱保存。3.RNA的提取和Real-time PCR4.蛋白的提取和Weatern blot5.血液检测:全血分离血浆后,监测血糖、胆固醇、甘油三酯、尿素氮、肌酐等糖尿病肾病相关指标,检测TNF-α等炎症指标,并作胰岛素的监测和糖耐量检查5.1胰岛素的监测:采用Crystal chem公司大鼠超敏胰岛素试剂盒检测5.2糖耐量检查:禁食4小时后,使用20%葡萄糖灌胃,分别于0、15、30、60、90分钟后采血,监测血糖和胰岛素水平。6.尿液检查:尿液检测尿蛋白、一氧化氮。7.HE染色结果1.肾小球系膜细胞的鉴定:1.1系膜细胞形态学观察:系膜细胞为贴附性生长细胞,呈星状或梭形,增殖活跃的细胞可呈放射状,细胞可聚集成小丘状。肾小球系膜细胞中结蛋白、纤维连接蛋白表达为阳性,因子Ⅷ相关抗原、角蛋白为阴性。12-24小时后,肾小球即可贴壁,并且有单细胞以此为中心向外生长。第三天可将原代培养细胞取出观察,用PBS冲洗,去除未贴壁的细胞、细胞碎片,并更换培养液。第5-6天可见卵石样成团的细胞和梭状单个细胞夹杂生长。7-10天梭状细胞逐渐占优势,卵石样成团细胞逐渐减少。细胞长满后,可进行传代。1.2免疫荧光鉴定:利用甲醛固定细胞后,用0.3%H2O2甲醇灭活内源性过氧化氢酶,0.1%Triton x-100通透细胞,加入鼠抗人结蛋白,鼠抗人角蛋白,分别加入FITC标记单克隆抗体,温浴后,使用荧光显微镜观察并摄影,对系膜细胞进行鉴定。培养肾小球系膜细胞结蛋白（+）,角蛋白（-）。2.PPAR在正常肾小球系膜细胞中的表达Real-time PCR结果表明,正常HMC中PPARα、γ、δmRNA均有特异性表达,Western-blot结果亦显示有PPARγ特定分子质量的条带出现,这些结果表明PPARα、γ、δ在正常HMC中均有表达。3.高糖和吡格列酮对PPARγ表达的影响3.1采用Real-time PCR的方法检测PPARα、γ、δ在正常糖浓度组、甘露醇对照组组、高糖组和吡格列酮处理组中的表达,用Ct值比较法即2-△△Ct法比较各组PPARα、γ、δmRNA相对表达量的变化。由图2看出,MG组中PPARγmRNA表达较NG组均无明显变化,高糖刺激下,PPARγmRNA表达降低了43%（P＜0.01）。而使用吡格列酮处理后,PPARγ的表达量较高糖处理时增加了1.92倍（P＜0.01）。在使用甘露醇的渗透压对照组中PPARγmRNA表达较NG组也有变化,但是变化小于高糖组和吡格列酮处理组,这说明高糖组和甘露醇处理组的基因表达变化不完全是因为渗透压变化引起的,高糖本身亦可引起PPARγ基因表达水平降低。3.2蛋白印迹结果表明,HG组PPARγ的蛋白表达较NG组表达降低（P＜0.01）,使用吡格列酮处理后PPARγ的蛋白表达较不使用吡格列酮组高糖组有明显提高（P＜0.01）,与其基因表达变化基本吻合。在使用甘露醇的渗透压对照组中PPARγmRNA表达较NG组也有变化,但是变化小于高糖组和吡格列酮处理组,表明渗透压的变化可导致PPARγ蛋白表达水平降低,但高糖本身亦可引起PPARγ蛋白表达水平降低。4.高糖和吡格列酮对Ⅳ型胶原表达的影响高糖可以明显地导致Ⅳ型胶原产生增加。使用30mM浓度葡萄糖处理的肾小球系膜细胞中Ⅳ型胶原的蛋白表达量明显高于530mM浓度葡萄糖处理的肾小球系膜细胞中Ⅳ型胶原的蛋白表达量（P＜0.01）,使用吡格列酮处理后,与未使用PIO高糖组比较能明显减少肾小球系膜细胞中Ⅳ型胶原的蛋白表达量（P＜0.01）。免疫荧光结果与蛋白印记实验结果吻合。5.PPARγ对机制金属蛋白酶平衡紊乱的调节作用5.1对MMP-2/TIMP-2平衡紊乱的调节作用高糖环境可以刺激MMP-2的表达,30mM葡萄糖处理的肾小球系膜细胞中MMP-2的表达比5mM葡萄糖处理的肾小球系膜细胞高1.07倍（p＜0.01）,使用吡格列酮处理可以抑制MMP-2的表达,比高糖组减少55%（p＜0.01）。高糖可以刺激MMP-2的组织抑制因子TIMP-2表达,30mM葡萄糖处理的肾小球系膜细胞中TIMP-2的表达比5mM葡萄糖处理的肾小球系膜细胞高2.45（p＜0.01）倍,而使用吡格列酮处理处理后,TIMP-2降低70%（p＜0.01）。30mM葡萄糖处理的肾小球系膜细胞中MMP-2/TIMP-2平衡降低了40%,而使用吡格列酮处理处理后使之恢复了29%。5.2对MMP-9/TIMP-1平衡紊乱的调节作用高糖环境可以抑制MMP-2的表达,30mM葡萄糖处理的肾小球系膜细胞中MMP-2的表达比5mM葡萄糖处理的肾小球系膜细胞降低39%（p＜0.01）,使用吡格列酮处理可以抑制MMP-9的表达,比高糖组减少60%（p＜0.01）。高糖可以刺激MMP-9的组织抑制因子TIMP-1表达,30mM葡萄糖处理的肾小球系膜细胞中TIMP-1的表达比5mM葡萄糖处理的肾小球系膜细胞高0.48（p＜0.01）倍,而使用吡格列酮处理处理后,TIMP-2降低65%（p＜0.01）。使用吡格列酮处理处理后可使MMP-9/TIMP-1平衡恢复44%。6.对ZDF大鼠糖尿病的控制及肾脏的保护作用6.1血液检测结果。6.1.1使用硝基油酸的ZDF大鼠的血糖和甘油三酯得到了很好的控制,不论是自身对照还是和未处理组大鼠对照,都有显著性差异（p＜0.01）。6.1.2使用硝基油酸的ZDF大鼠血中的胰岛素有明显的减少,说明ZDF大鼠体内的胰岛素抵抗有明显的改善。不论是自身对照还是和未处理组大鼠对照,都有显著性差异（p＜0.01）。6.2尿液检测结果6.2.1尿液白蛋白检测使用硝基油酸的ZDF大鼠的尿白蛋白较处理前有明显减轻（p＜0.01）,同时与对照组比较,亦有明显减轻（p＜0.01）。6.3使用硝基油酸对ZDF大鼠血压的影响使用硝基油酸的ZDF大鼠的血压降低了20mmHg,说明硝基油酸可以有效地控制糖尿病导致的血压增高。6.4使用硝基油酸对ZDF大鼠体重的影响使用硝基油酸的ZDF大鼠的体重降低,而未使用使用硝基油酸的ZDF大鼠体重持续增长,说明硝基油酸可以有效地控制糖尿病导致的体重增高。6.5使用硝基油酸对ZDF大鼠红细胞压积的影响使用硝基油酸的ZDF大鼠的红细胞压积未见明显改变,维持在正常范围,说明硝基油酸没有导致体内水钠潴留。7.对C57小鼠炎症的控制7.1硝基油酸预处理48小时后,给与腹腔注射致死剂量LPS。24小时后,处理组生存率为100%,而非处理组全部死亡。7.2血液检测结果。7.2.1使用硝基油酸的C57小鼠的炎症反应得到了很好的控制,与对照组小鼠比较,使用硝基油酸组的尿素氮、肌苷有显著性降低（p＜0.01）,说明硝基油酸在炎症情况下能有效地减轻炎症,保护重要脏器功能。7.2.2使用硝基油酸的C57小鼠的血液TNF-α明显低于未使用硝基油酸小鼠,说明使用硝基油酸的C57小鼠的炎症反应得到了控制。7.3 western-blot结果使用硝基油酸的C57小鼠的肾脏组织中NF-KB的表达量,明显低于未使用硝基油酸处理的小鼠,说明使用硝基油酸可以有效地减弱CLP手术导致的感染。7.4 C57小鼠肾脏HE染色结果肾脏病理显示未使用硝基油酸处理的C57小鼠肾脏肾小球、肾小管排列紊乱,肾小管上皮细胞发生变性、坏死、脱落。而使用硝基油酸处理的C57小鼠肾脏未出现上述变化。8.使用硝基油酸对PPARα、β、γmRNA的影响使用硝基油酸的ZDF大鼠的肾脏组织中PPARα、β、γmRNA的表达分别增加,说明硝基油酸可以有效地激动PPARα、β、γ的表达,使一种有效的内源性PPAR激动剂。9.使用硝基油酸对体内一氧化氮产生的影响使用硝基油酸处理可以有效地增加ZDF大鼠尿中的硝酸盐/亚硝酸盐的产生,这说明硝基油酸处理可以有效地增加ZDF大鼠体内一氧化氮产生。结论:1.我们的研究表明,高糖能抑制PPARγ基因、蛋白表达,刺激Ⅳ型胶原产生,使肾小球系膜细胞金属机制蛋白酶系统发生紊乱,使用PPARγ激动剂吡格列酮处理可以改善上述情况,提示PPARγ可以通过调节金属机制蛋白酶系统来调节细胞外基质的降解,从而对糖尿病时肾小球系膜细胞细胞外基质蓄积产生影响,PPAR介导的信号转导途径在DN的发生发展中发挥重要作用。2.硝基油酸能很好的控制糖尿病,保护肾脏功能,同时不产生其他PPARγ激动剂导致的水钠潴留,是一种良好的内源性PPAR激动剂。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 第一部分 吡格列酮对糖尿病肾病肾脏纤维化的治疗作用及机制探讨
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 附表和附图
• 参考文献
• 第二部分 硝基油酸对糖尿病肾病的治疗作用探讨
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 附表和附图
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 学位论文评阅及答辫情祝轰
• 附件