猪细小病毒DNA疫苗pCDNA3.1（+）-VP2-CpG的构建

论文摘要

猪细小病毒（Porcine Parvovirus,PPV）自二十世纪六十年代被发现以来,许多国家先后分离到该病毒和检测到其抗体,抗体检出率为50%-80%,其中我国高达80%。该病毒感染能引起以母猪繁殖障碍为主要特征的病毒性传染病,孕前期受到感染时,经胎盘使胚胎或胎儿受到侵袭,引起母猪流产、不孕、胚胎死亡、胎儿崎形及木乃伊化等,同时还可引起仔猪的皮炎和腹泻,给养猪业造成巨大的经济损失。疫苗的开发是有效防范PPV的关键。DNA疫苗是继病原体疫苗、亚单位疫苗之后的第三代疫苗,具有许多的优越性。本试验研究利用设计出的引物扩增PPV VP2主要抗原基因,得到1146bp的基因片段,并推导出382aa氨基酸序列,应用DNAstar软件对氨基酸的抗原表位进行了预测。将该VP2基因克隆到真核表达载体pCDNA3.1（+）中,构建出pCDNA3.1（+）-VP2真核表达重组质粒,同时设计并合成一条93bp的含CpG-ISS的寡核苷酸,将其插入构建的pCDNA3.1（+）-VP2真核表达重组质粒中构建了pCDNA3.1（+）-VP2-CpG。将pCDNA3.1（+）-VP2和pCDNA3.1（+）-VP2-CpG这两种质粒分别转染COS-7细胞,利用免疫荧光技术检测表明,这两种质粒均能在COS-7细胞中表达VP2蛋白。将构建好的重组质粒进行大量提取,以肌肉注射的方法将重组质粒接种于健康的昆明小鼠体内,试验分pCDNA3.1（+）空载体组（100μg/只）、pCDNA3.1（+）-VP2组（100μg/只）、pCDNA3.1（+）-VP2-CpG组（100μg/只）、空白对照组。在0、2、4、5、6周分别采集并分离小鼠血清,用ELISA法检测其中的抗PPV特异性抗体。实验结果显示,小鼠在接种重组质粒pCDNA3.1（+）-VP2和pCDNA3.1（+）-VP2-CpG后,其PPV特异性抗体的检测均为阳性,且pCDNA3.1（+）-VP2-CpG免疫组抗体水平高于pCDNA3.1（+）-VP2组。结果显示,插入CpG免疫刺激序列的DNA疫苗能进一步提高抗体水平,因此将CpG-ISS克隆进质粒中是提高DNA疫苗免疫活性的一条有效途径。这为进一步研制安全、有效的PPVDNA疫苗奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 PPV的发现及现状
• 1.2 PPV的流行病学
• 1.3 PPV的病毒特性
• 1.4 PPV的分子生物学研究
• 1.5 PPV的诊断技术
• 1.6 PPV的疫苗研究进展
• 1.7 核酸疫苗研究进展
• 2、研究的目的和意义
• 3、材料
• 3.1 质粒、宿主菌、细胞和实验动物
• 3.2 主要的酶及试剂
• 3.3 主要仪器
• 4、方法
• 4.1 VP2主要抗原表位基因的扩增
• 4.2 PCR产物的回收
• 4.3 VP2主要抗原表位基因的克隆
• 4.4 阳性菌落的筛选与鉴定
• 4.5 重组质粒pcDNA3.1（+）-VP2的构建
• 4.6 CpG免疫刺激序列的制备
• 4.7 重组质粒pcDNA3.1（+）-VP2—CpG的构建
• 4.8 重组真核表达质粒在COS-7细胞中的瞬时表达
• 4.9 DNA疫苗对小鼠免疫效果的研究
• 5、结果
• 5.1 PCR结果
• 5.2 克隆质粒酶切鉴定结果
• 5.3 目的基因的测序及分析结果
• 5.4 重组质粒pcDNA3.1（+）-VP2的酶切及菌落PCR鉴定结果
• 5.5 CpG序列的PCR扩增
• 5.6 克隆质粒pBS-T-CpG的酶切鉴定
• 5.7 CpG免疫刺激序列的测序结果
• 5.8 重组质粒pcDNA3.1（+）-VP2-CpG的酶切及PCR鉴定结果
• 5.9 重组真核表达载体体外表达产物的荧光检测
• 5.10 动物实验检测核酸疫苗免疫效果
• 6、讨论
• 6.1 目的基因的选择
• 6.2 表达载体的选择
• 6.3 关于CpG免疫刺激序列
• 6.4 转染的方法
• 6.5 DNA疫苗的接种方式
• 6.6 核酸疫苗免疫效果
• 7、结论
• 参考文献
• 致谢
• 实验试剂的配置