蜡梅开花过程基因表达的ESTs分析与凝集素基因功能的初步鉴定

论文摘要

蜡梅（Chimonanthus praecox （L．） Link）是蜡梅科（Calycanthaceae）蜡梅属（Chimonanthus Lindl．）植物，为原产我国的落叶丛生灌木。蜡梅花在12月至翌年早春2月孕蕾开花、花香宜人以及其特殊的抗逆性状令人关注。目前人们对蜡梅开花与花香形成的分子机理研究缺乏，没有从蜡梅中克隆到抗逆基因的报道，对蜡梅开花过程中的基因表达情况不清楚。本论文从构建蜡梅花cDNA文库入手，利用EST技术分析开花过程中的基因表达情况，在此基础上，克隆蜡梅凝集素基因，利用转基因手段初步分析其抗虫性。主要取得以下结果： 1．蜡梅花cDNA文库构建 用SMART cDNA文库构建试剂盒成功构建了蕾期、露瓣期、初开期、盛开期蜡梅花混合cDNA文库。原始文库滴度达到1.4×106pfu／ml，扩增文库滴度约为1010pfu／ml，重组率达96％，插入片段在0.5 kb以上，平均约1.1kb。通过PCR检测，从扩增文库中检测到了蜡梅PI、AP3和LTP基因的特异片段，说明所构建的文库覆盖度高、代表性强。LTP基因具有内含子，而通过PCR从文库中扩增出的LTP基因不含内含子，说明所构建的cDNA文库无基因组DNA污染。这是第一次正式报道蜡梅cDNA文库的构建。 2．蜡梅花EST序列测定与拼接 从蜡梅花cDNA文库首先挑取噬菌斑克隆，然后转变为质粒，PCR筛选阳性克隆进行正向序列测定获得了896个原始序列，经SeqMan、BLAST分析后得到蜡梅花的有效EST序列867条，有效率为96.76％。全部片段长为584201bp，平均读长为673.8bp。进而转化成GenBank提交格式提交GenBank数据库，登录号从DW222667到DW223533。 利用DNASTAR软件包的SeqMan Ⅱ程序对867条有效EST序列进行序列拼接后得到479个不同的独立基因（contigs，含singlet），冗余序列占全部序列的44.8％。 根据不同独立基因（contigs，含singlet）的EST数量统计，蜡梅开花过程低丰度表达

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 蜡梅（Chimonanthus praecox （L.） Link）研究与利用
• 1.1.1 名称与种属关系辨析
• 1.1.2 品种分类与选育
• 1.1.3 植物学特征
• 1.1.4 生理生化研究
• 1.1.5 应用
• 1.2 基因表达序列标签（EST）及其发展
• 1.2.1 EST与EST技术简介
• 1.2.2 EST与EST技术的发展
• 1.2.3 EST在基因组学研究中的应用
• 1.3 植物凝集素及其抗虫基因工程研究进展
• 1.3.1 植物凝集素的命名
• 1.3.2 植物凝集素的分布
• 1.3.3 植物凝集素的类型
• 1.3.4 植物凝集素的稳定性
• 1.3.5 植物凝集素的功能
• 1.3.6 植物凝集素在植物抗虫基因工程研究中的应用
• 第2章 引言
• 第3章 蜡梅花cDNA文库的构建
• 3.1 技术路线
• 3.2 材料
• 3.2.1 植物材料
• 3.2.2 菌株
• 3.2.3 主要试剂
• 3.2.4 主要仪器设备
• 3.2.5 自配的主要试剂与培养基
• 3.3 方法
• 3.3.1 蜡梅花（芽）的采集与处理
• 3.3.2 蜡梅花（芽）总RNA提取
• 3.3.3 琼脂糖凝胶电泳检测RNA
• 3.3.4 紫外分光光度法测定RNA
• 3.3.5 第一链cDNA的合成
• 3.3.6 LD-PCR扩增第一链cDNA合成双链cDNA
• 3.3.7 cDNA的蛋白酶K处理
• 3.3.8 cDNA的SfiI酶切
• 3.3.9 CHROMA SPIN-400对cDNA进行分级分离
• 3.3.10 全长cDNA的沉淀浓缩
• 3.3.11 cDNA与载体λTriplEx2连接
• 3.3.12 连接产物—重组λ载体的包装
• 3.3.13 原始文库的滴度测定
• 3.3.14 原始文库重组率及插入片段大小的确定
• 3.3.15 原始文库的扩增
• 3.3.16 扩增文库的滴度测定
• 3.3.17 蜡梅基因组DNA提取
• 3.3.18 扩增文库覆盖度的检测
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 RNA提取
• 3.4.2 文库cDNA第一链的LD-PCR
• 3.4.3 CHROMA SPIN-400对cDNA分级分离
• 3.4.4 cDNA文库的质量评价
• 3.5 讨论
• 3.5.1 样品采集的代表性
• 3.5.2 mRNA质量
• 3.5.3 cDNA文库质量
• 3.6 小结
• 第4章 EST序列测定及初步分析
• 4.1 技术路线
• 4.2 材料
• 4.2.1 蜡梅花cDNA文库
• 4.2.2 菌株
• 4.2.3 主要试剂
• 4.2.4 自配的主要试剂与培养基
• 4.3 方法
• 4.3.1 独立噬菌斑的挑取
• 4.3.2 质粒转化宿主菌BM25.8的准备
• 4.3.3 噬菌体向质粒的转化
• 4.3.4 菌液PCR筛选阳性克隆并测序
• 4.3.5 拼接前处理（pre-processing）
• 4.3.6 拼接（assembly）
• 4.3.7 同源性预比较
• 4.3.8 最高频率出现的脂转移蛋白cDNA的表达
• 4.3.9 序列格式转化及GenBank数据库提交
• 4.3.10 EST序列相似性比较及注释结果的功能分类
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 测序结果与有效EST的获得
• 4.4.2 蜡梅LTP基因的表达分析
• 4.4.3 序列提交
• 4.4.4 片段重叠群分析及基因表达丰度分析
• 4.4.5 EST序列相似性比较分析与功能注释
• 4.4.6 基因GO分类结果
• 4.4.7 蜡梅基因的生物学功能分类
• 4.5 讨论
• 4.5.1 EST功能注释与分类
• 4.5.2 数码杂交
• 4.5.3 蜡梅开花过程基因表达概况
• 4.6 小结
• 第5章 蜡梅凝集素基因的克隆及对烟草的转化
• 5.1 技术路线
• 5.2 材料
• 5.2.1 植物材料
• 5.2.2 菌株与载体
• 5.2.3 主要生化试剂
• 5.2.4 常用溶液配方
• 5.2.5 基本培养基配方
• 5.3 方法
• 5.3.1 蜡梅Cplectin基因的克隆
• 5.3.2 Southern杂交
• 5.3.3 蜡梅Cplectin植物表达载体构建
• 5.3.4 Cplectin基因导入烟草及转化植株的获得
• 5.3.5 蜡梅Cplectin基因功能初步验证-抗虫性实验
• 5.4 结果与分析
• 5.4.1 Cplectin基因的cDNA序列特征
• 5.4.2 Cplectin基因编码蛋白性质分析
• 5.4.3 蜡梅Cplectin基因全长cDNA对应的基因组DNA序列中内含子的检测
• 5.4.4 蜡梅Cplectin基因的Southern杂交结果
• 5.4.5 植物表达载体pBI-Lec的构建
• 5.4.6 蜡梅Cplectin基因导入烟草及转化植株的获得
• 5.4.7 Cplectin基因抗虫性检测
• 5.5 讨论
• 5.5.1 Cplectin的结构特点
• 5.5.2 转Cplectin基因的抗虫试验
• 5.5.3 植物凝集素用于植物抗虫基因工程
• 5.6 小结
• 5.6.1 蜡梅Cplectin基因的克隆
• 5.6.2 蜡梅Cplectin基因表达载体构建及转基因烟草的获得
• 5.6.3 转蜡梅Cplectin基因烟草的抗虫性
• 第6章 总结
• 6.1 主要结论
• 6.2 主要创新点
• 6.3 本论文主要不足
• 6.4 进一步研究设想
• 参考文献
• 附录
• 缩略词
• 致谢