黑盖木层孔菌多糖化学结构和生物活性研究

论文摘要

本论文主要通过生物发酵技术培养黑盖木层孔菌;确定最优培养基;并且从菌丝体和发酵液中提取、纯化得到水溶性多糖;研究多糖的化学结构及抗肿瘤和免疫活性,并探讨多糖的结构与生物活性之间的关系。首先筛选了适宜黑盖木层孔菌菌丝体生长的碳源和氮源。最优碳源为可溶性淀粉,最优氮源为玉米面,菌丝的生长速度在有机氮源培养基上要明显优于无机氮源,确定蔗糖-玉米面为黑盖木层孔菌的最佳碳-氮源组合。并且,该菌种适宜液体发酵培养。黑盖木层孔菌经发酵培养后,得到发酵菌丝体,确定菌丝体多糖的最优提取条件为:提取温度100℃,浸提4次,每次2小时,浸提比1:30,各因素影响的大小次序是:提取次数>浸提比>浸提时间。分别从菌丝体和发酵液中分离得到水溶性粗多糖:菌丝体粗多糖PNW和胞外粗多糖PNM。GC分析粗多糖组成:PNW由甘露糖和葡萄糖构成,摩尔比为2.68:1.00;PNM由甘露糖、半乳糖和葡萄糖构成,摩尔比为2.02:1.00:3.21。采用冻融分级、脱蛋白、离子交换层析和分子筛凝胶层析等方法,分别从PNW和PNM中纯化出多糖PNW1和PNM1。HPLC检验PNW1和PNM1均为单一峰,平均分子量分别为33 kDa和29 kDa。GC分析,PNW1和PNM1均为杂多糖,由葡萄糖、半乳糖、甘露糖及少量的阿拉伯糖和岩藻糖组成,其摩尔比分别为3.26:8.77:6.44:1.00:1.35和20.06:8.72:6.94:1.00:0.76。采用部分酸水解、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化等化学分析方法及IR、GC、GC-MS、13C NMR等仪器分析方法对PNW1和PNM1进行结构分析。确定了PNW1和PNM1的结构重复单元。PNW1的基本结构为:1→6- Glc和1→6- Gal构成主链,从Glc和Gal的O-2连接侧链,侧链由1→6- Man短链和Ara、Fuc、Man的末端构成。PNM1的基本结构为:1→6- Glc和1→6-Gal构成主链, Glc的O-2连接侧链,侧链由1→6- Man短链和Ara、Fuc、Glc、Man的末端构成。建立BALB/c小鼠体内S- 180实体瘤模型,进行体内抗肿瘤活性试验。经测定,菌丝体多糖和胞外多糖均能抑制小鼠体内移植性肿瘤S- 180的生长。并且,菌丝体多糖%的抗肿瘤活性优于胞外多糖。其中PNW1在400 mg/kg时抑瘤率最高,达到74.70%。在体外实验中,菌丝体多糖和胞外多糖对S- 180细胞没有的明显抑制作用。菌丝体多糖和胞外多糖均有免疫调节功能,能增加荷瘤小鼠的脾相关系数和胸腺相关系数,调节血清中的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的含量。多糖与脾淋巴细胞或巨噬细胞共培养后,表现出增强淋巴细胞的增殖和腹腔巨噬细胞的吞噬作用,并且促进巨噬细胞分泌NO和TNF-α。推测,其抗肿瘤作用是通过调节宿主的免疫机能实现的,可能与巨噬细胞有关。PNW1和PNM1的分子量相近,在30 kDa左右,均由葡萄糖、半乳糖、甘露糖及少量的阿拉伯糖和岩藻糖组成,各单糖的含量不同,结构也不同,但是他们的结构有共同的特点:主链是由1→6- Glc和1→6- Gal共同构成,由O-2连接侧链,侧链残基为1→6- Man短链。推测,分子量不高的带有O-2分支点的1→6真菌杂多糖具有抗肿瘤和免疫活性。比较两种多糖的活性,PNW1的抗肿瘤活性明显优于PNM1,免疫活性也优于PNM1,表明真菌多糖的抗肿瘤活性也与糖苷键的类型及其位置有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 真菌多糖概述
• 1.1.1 真菌的发酵生产进展
• 1.1.2 真菌多糖生物活性
• 1.1.3 真菌多糖的化学结构
• 1.1.4 真菌多糖结构与活性关系
• 1.2 真菌多糖的研究方法概述
• 1.2.1 真菌多糖的提取和纯化
• 1.2.2 真菌多糖的结构研究
• 1.3 本课题研究的目的和意义
• 参考文献
• 第二章 黑盖木层孔菌发酵条件的研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 供试菌株
• 2.2.2 母种培养基
• 2.2.3 母种的分离
• 2.2.4 培养基的筛选
• 2.2.5 液体发酵培养及不同代数菌丝体多糖的分析
• 2.3 结果和讨论
• 2.3.1 不同碳源对黑盖木层孔菌菌丝生长的影响
• 2.3.2 不同氮源对黑盖木层孔菌菌丝生长的影响
• 2.3.3 最佳碳氮源组合的筛选
• 2.3.4 不同代数菌丝体多糖的分析
• 2.4 结论
• 参考文献
• 第三章 黑盖木层孔菌多糖的分离提取和纯化
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂
• 3.2.2 菌丝体多糖的提取及提取条件的优化
• 3.2.3 胞外多糖的提取
• 3.2.4 多糖的纯化
• 3.2.5 多糖的理化性质研究
• 3.3 结果和讨论
• 3.3.1 菌丝体多糖提取条件的优化试验
• 3.3.2 胞外多糖的提取
• 3.3.3 粗多糖的特征
• 3.3.4 多糖的纯化
• 3.3.5 PNW1 和PNM1 理化性质研究
• 3.4 结论
• 参考文献
• 第四章 黑盖木层孔菌多糖的结构研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 试剂和仪器
• 4.2.2 碘反应实验
• 4.2.3 红外光谱分析
• 4.2.4 部分酸水解
• 4.2.5 高碘酸氧化和Smith 降解
• 4.2.6 甲基化分析
• 13NMR'>4.2.7 C¹³NMR
• 4.3 结果和讨论
• 4.3.1 红外光谱分析
• 4.3.2 PNW1 的结构分析
• 4.3.3 PNM1 的结构分析
• 4.4 结论
• 参考文献
• 第五章 黑盖木层孔菌多糖的生物活性测定
• 5.1 引言
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 材料和试剂
• 5.2.2 抗肿瘤研究
• 5.2.3 免疫活性测定
• 5.2.4 统计方法
• 5.3 结果和讨论
• 5.3.1 多糖的抗肿瘤活性
• 5.3.2 多糖对淋巴细胞转化功能的影响
• 5.3.3 多糖对Mφ功能的影响
• 5.4 结论
• 参考文献
• 论文总结
• 致谢
• 在学期间公开发表论文及著作情况