论文题目: 新型冠状病毒实验室诊断方法学研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 有机化学
作者: 李振勇
导师: 赵玉芬
关键词: 传染性非典型肺炎,新型冠状病毒,酶联免疫,病毒样颗粒,双抗原夹心,酶免杂交,内对照,荧光
文献来源: 郑州大学
发表年度: 2005
论文摘要: 2002年11月,中国广东省出现了首例传染性非典型肺炎患者,世界卫生组织根据临床症状于2003年3月15日将其命名为严重急性呼吸道综合症——Severe Acute Respiratory Syndrome(SARS),并于4月16日根据多国协作研究成果,正式宣布SARS的病原体为一种变异的新型冠状病毒(正单链RNA病毒,SARS CoV)。其后,WHO公布的资料显示,全球共计出现非典病人和疑似病人8450例,其中死亡784人,涉及33个国家和地区。由于其病征与感冒、腹泻等常见病病征相似,容易造成临床上的疑诊和误诊。因此,开展相关检测方法和试剂的研发,提供对SARS的早期诊断结果,是进行疾病预防、阻断传播、保护人类自身的首要措施之一,是世界性医学和社会的重大课题。 近两年的研究表明,SARS CoV S蛋白的受体已经很清楚(ACE2),是病毒的主要保护性抗原,N蛋白和M蛋白也可以诱导免疫效应,是检测病毒抗体的良好抗原。本研究根据基因扩增、克隆表达和酶联免疫技术,结合生物信息学、F(?)ster等理论,以基因工程、荧光探针、高效核酸杂交等先进技术手段,提出了简单二级结构高熵值靶序列、空间压缩荧光/淬灭、反转录/抗污染整合等新思路,克服了荧光探针背景过高、RNA提取效率低、阳性对照具有潜在传染性/不稳定、反转录和抗污染不能兼顾等技术难题,取得了特异、适合检测的靶序列和引物、TaqMan-BC探针、高效提取方法、病毒样颗粒阳性对照和内对照、反转录/UNG系统抗污染、cDNA富集等技术创新,建立了荧光RT-PCR基因检测、酶免RT-PCR基因检测、酶免抗体检测等方法和试剂,是SARS早期鉴别诊断、病程监测、预后和流病调查的重要手段,社会意义巨大。 一、根据生物信息学理论,将核酸序列简单二级结构新思路引入靶序列的选择上。并根据基因组信息分析结果,获得了适合基因检测的高熵值靶序列;成功地设计了独特的TaqMan-BC荧光探针,将实际检测本底降低2倍以上; 二、建立了高效简便的核酸提取方法,巧妙设计了反转录/UNG抗污染、cDNA富集、扩增一体化组合的反应体系,在有效提高灵敏度的同时彻底解决了PCR实验过程中容易出现的污染问题,检测灵敏度达到45Copies/mL。 三、整合了RT-PCR和快速核酸杂交技术,通过化学交连,将探针高效地固定在
论文目录:
第一章 引言
1．1 传染性非典型肺炎的发现
1．1．1 传染性非典型肺炎的发现过程
1．1．2 传染性非典型肺炎疫情
1．1．3 全球非典型肺炎的防治措施
1．2 冠状病毒回顾
1．2．1 冠状病毒研究历史
1．2．2 冠状病毒科的分类
1．2．3 冠状病毒理化性质
1．2．4 冠状病毒的流行病学
1．2．5 冠状病毒的临床特点
1．2．6 新型冠状病毒特点
1．3 病原体检测方法回顾
1．4 SARS CoV检测方法
1．4．1 免疫学方法
1．4．2 基因检测
1．5 博士论文的设计思路和研究内容
第二章 新型冠状病毒(SARS CoV)基因组信息学
2．1 引言
2．2 实验方法
2．3 结果与讨论
2．3．1 基因组基本情况
2．3．2 基因组结构分析
2．3．3 基因变异分析
2．3．4 进化分析
2．3．4 靶序列的选择、引物、探针设计和分析
2．4 结论
第三章 新型冠状病毒(SARS CoV)基因重组
3．1 引言
3．2 材料与仪器
3．3 实验方法
3．3．1 抗核糖核酸酶的SARS CoVRNA片断重组病毒样颗粒的构建
3．3．2 重组SARS内对照(SARS-IC)病毒样颗粒的构建
3．3．3 SARS CoV结构基因M、N蛋白的克隆、表达
3．4 结果与讨论
3．5 结论
第四章 新型冠状病毒(SARS CoV)核酸荧光 PCR检测研究
4．1 引言
4．2 材料与仪器
4．3 实验方法
4．3．1 引物、探针合成
4．3．2 荧光探针的标记
4．3．3 引物和探针的检测
4．3．4 高效样品处理方法的研究
4．3．5 反转录扩增检测体系的建立及优化
4．3．6 实验数据分析
4．3．7 检测方法的灵敏度、特异性评价
4．3．8 实验阴阳对照、灵敏度和特异性样本、全程系统内参照物的制备
4．4 结果与讨论
4．5 结论
第五章 新型冠状病毒(SARS CoV)酶免 PCR检测方法研究
5．1 引言
5．2 材料与仪器
5．3 实验方法
5．3．1 探针、引物的设计与合成、检测分析
5．3．2 样品处理、反转录/cDNA富集、PCR扩增体系的构建
3．3．3 阳性对照
5．3．4 捕获微孔板的研制
5．3．5 微孔板杂交体系的构建
5．4 结果与讨论
5．5 结论
第六章 新型冠状病毒(SARS CoV)抗体酶免检测方法研究
6．1 引言
6．2 材料与仪器
6．3 实验方法
6．3．1 制备SARS免疫抗血清
6．3．2 双抗原夹心法检测模式的设计
6．3．3 酶标记抗原结合物的制备
6．3．4 抗原搭配实验
6．3．5 酶联免疫工艺过程的确定
6．3．6 检测方法参比品的配制
6．4 结果与讨论
6．5 结论
第七章 新型冠状病毒(SARS CoV)检测方法临床评价
7．1 引言
7．2 SARS CoV抗体酶免检测方法的临床评价
7．3 SARS CoV PCR检测方法的临床评价
7．4 荧光 PCR、酶免 PCR和双抗原夹心法比较
7．5 结论
第八章 研究总结
参考文件
在读期间发表或接收的论文
获奖和技术应用情况
致谢
发布时间: 2005-10-25
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