花粉管通道法介导aiiA和TuMV-CP基因转化大白菜的研究

论文摘要

大白菜（Brassica campestris L. ssp. pekinensis）原产于中国,是我国蔬菜栽培中分布最广,种植面积最大的蔬菜作物之一,在我国尤其是北方地区的“菜篮子工程”中占有举足轻重的地位。但是,近年来随着大白菜栽培面积的不断扩大和种植年限的不断增加,软腐病、病毒病等许多病害有加重发展的趋势,严重地影响了大白菜的生产。本研究通过花粉管通道法将aiiA,TuMV-CP基因导入大白菜,期望获得抗病转基因植株,为大白菜的抗病育种奠定理论基础。研究结果如下:1.根据aiiA基因的已知序列,克隆该基因,以植物表达载体pBBBast+为目标载体,通过酶切、连接、筛选、鉴定等操作构建了植物表达载体pBBBast-aiiA。2.本研究利用pET-29a构建了pET29a-aiiA原核表达载体,制备了E.coli BL21（DE3）-pET29a-aiiA工程菌。通过对融合表达条件（如温度、IPTG浓度及诱导时间）进行优化并用SDS-PAGE检测,结果表明,在20℃低温,0.8 mmol/L IPTG诱导表达25 h条件下可获得含量最高的可溶性AiiA蛋白51.1μg/mL。3.纯化后的AiiA蛋白和破壁上清液经活性检测和抑菌抗病实验,结果表明均具有良好的AiiA活性和良好抑菌效果。4.通过花粉管通道法,将aiiA,TuMV-CP基因转入大白菜“二牛心”品种中。对转基因植株进行PCR和PCR-Southern验证,获得了转aiiA基因大白菜5株,转化率为0.0242%;转TuMV-CP基因大白菜29株,转化率为0.1531%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 研究的目的与意义
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 aiiA 基因及其应用
• 1.2.2 TuMV-CP 基因及其应用
• 1.2.3 花粉管通道法
• 1.2.4 大白菜抗病基因工程研究进展
• 1.3 研究内容
• 1.4 技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 aiiA 基因的获得和植物表达载体的构建
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 aiiA 原核表达载体的构建及AiiA 蛋白活性的检测
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 试验方法
• 2.3 花粉管通道法介导aiiA，TuMV-CP 基因转化大白菜
• 2.3.1 实验材料
• 2.3.2 实验方法
• 2.4 抗性苗的筛选及分子生物学鉴定
• 2.4.1 转化株的筛选
• 2.4.2 转基因植株分子生物学鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 aiiA 基因的获得和植物表达载体的构建
• 3.1.1 aiiA 基因的PCR 扩增
• 3.1.2 aiiA 基因与克隆载体pMD19-T simple vector 的连接
• 3.1.3 重组质粒pMD19-T-aiiA 的双酶切鉴定
• 3.1.4 aiiA 基因的序列测定和验证
• 3.1.5 植物表达载体的构建
• 3.2 aiiA 原核表达载体的构建及AiiA 蛋白活性的检测
• 3.2.1 原核表达载体pET29a-aiiA 的构建
• 3.2.2 AiiA 蛋白的融合表达条件的优化
• 3.2.3 纯化结果
• 3.2.4 AiiA 蛋白活性的检测
• 3.3 花粉管通道法介导 aiiA,TuMV-CP 基因转化大白菜
• 3.3.1 种子收获
• 3.3.2 抗性植株的筛选
• 3.3.3 抗性植株的分子生物学检测
• 4 讨论
• 4.1 目的基因的选择
• 4.2 AiiA 蛋白的可溶性表达
• 4.3 外源 DNA 片段大小对转化效果的影响
• 4.4 花粉管通道技术在大白菜遗传改良中的应用前景
• 4.5 今后研究方向与展望
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 图版
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文