合成启动子及CBF异位表达对转基因烟草生长发育的影响

论文摘要

环境胁迫（干旱、低温和盐）是影响植物和造成重要农作物严重减产的主要自然灾害。许多植物经过低温锻炼后可显著提高抗冻性,即冷驯化。冷驯化过程中,大量基因被诱导表达,这些基因中有许多的启动子区含有CRT/DRE顺式作用元件。业已证明,冷响应转录激活因子CBF是植物冷驯化的关键调节因子,CBF特异地与CRT/DRE相互作用从而诱导含有该元件的抗逆基因表达。在转基因植物中过量表达CBF可以在通常生长条件下,激活许多抗逆相关基因的表达并显著提高植物的抗旱、抗盐和抗冻能力。但高水平表达CBF,例如使用组成型强启动子CaMV 35S启动子,往往导致转基因植物生长发育严重受阻,影响其在作物抗逆基因工程中的应用。使用胁迫诱导型启动子rd29A,使CBF只在胁迫诱导时表达,则既减小了对植物生长的影响,又获得了甚至比使用35S启动子更好的抗逆效果。我们设想,用化学诱导型启动子控制CBF的表达,将可以更好地解决过量表达CBF引起的植物生长发育迟滞问题,并使CBF只在需要时表达。有本研究利用植物防御基因中的病原诱导响应元件和最小35S启动子（-62～+1）,人工合成了2个启动子——C2W和SAR,并以GUS基因为报告基因,在转基因拟南芥中分析了合成启动子的表达特性。分别用C2W启动子和35S启动子与拟南芥CBF1、CBF3基因以及小拟南芥COR15a基因表达框架组合构建了6个植物表达载体,并转化烟草。通过调查异位表达CBF的转基因烟草的生长发育,研究探讨了CBF影响植物生长发育的原因。结果如下:1. SAR启动子具有组织和发育表达特异性:对转基因拟南芥GUS组织染色的分析表明,SAR启动子在子叶、毛刺、根茎交接处和根系中优势表达,在老叶中的表达量高于幼叶中的。2. C2W和SAR启动子均响应机械损伤的诱导。3.过量表达AtCBF1（35S:: AtCBF1）严重影响转基因烟草的生长发育:植株矮化、去顶端优势化、叶片畸形、早衰、开花延迟或不育。4.使用合成启动子C2W的AtCBF1转基因烟草,在外观形态上与野生型无明显区别。说明,在正常条件下,合成启动子C2W本底表达水平较低。半定量RT-PCR分析结果表明,AtCBF1的转录表达受水杨酸的诱导,2mM水杨酸可获得最大的诱导效果。10mM以上水杨酸对烟草有损害。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 文献综述
• 1.1 CBF 低温响应转录因子与植物抗逆性
• 1.2 植物启动子研究
• 1.3 赤霉素的生物合成代谢及其调节
• 1.4 本研究的意义、依据和技术路线
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3. 结果与分析
• 3.1 小拟南芥COR15A 基因的分离和序列分析
• 3.2 小拟南芥CBF 基因的分离和序列分析
• 3.3 启动子片段的合成
• 3.4 合成启动子SAR 在拟南芥中具有组织表达特异性
• 3.5 合成启动子SAR 具有伤诱导活性
• 3.6 合成启动子C2W 具有伤诱导表达特性
• 3.7 合成启动子C2W 受水杨酸诱导表达
• 3.8 CBF 基因表达载体构建及转基因烟草的获得
• 3.9 355 启动子转基因烟草表型
• 3.10 组成型表达CBF 的转基因烟草发育情况
• 3.11 转CBF 基因烟草的矮化表型可被GA3 逆转
• 3.12 在合成启动子驱动下CBF 转基因烟草形态和发育正常
• 3.13 转ATCBF1 和APCOR15A 的双价转基因烟草
• 3.14 双价转基因烟草叶长宽比增加而株高变化不显著
• 3.15 双价转基因烟草中，CBF 受SA 诱导表达
• 3.16.CBF对烟草叶片中赤霉素代谢相关基因表达的影响
• 4. 讨论
• 4.1 CBF 及其在植物抗逆育种中的应用
• 4.2 化学诱导型启动子的合成
• 4.3 不同启动子作用下，CBF 对转基因植物生长发育影响
• 4.4 赤霉素代谢途径部分可能受CBF 的调控
• 5. 结论
• 参考文献
• 缩略词表
• 附录
• 致谢