趋化因子CCL2及其受体CCR2，以及钙离子结合蛋白S100A11，S100A6调节肝脏再生功能的实验研究

论文摘要

肝脏是机体中最大的消化器官,也是体内新陈代谢的重要场所,同时肝脏也是机体唯一具有再生能力的器官。在正常情况下,绝大部分的肝细胞处于细胞周期的静息期,仅有0.001%0.01%的肝细胞在进行有规律的DNA复制。而当肝脏受到病理性损伤或者手术切除后,肝细胞便由原来的静息期进入G1期,从而进行有丝分裂,细胞大量增殖,最终恢复到受损前的大小,从而完成肝脏的再生。肝脏再生机制的研究对于肝脏再生能力丧失或受损病人的救治以及肝脏功能的恢复都具有十分重要的意义。目前认为肝脏再生过程中所必需的途径大致可归为细胞因子网络,生长因子网络和代谢网络等三个信号网络,三者相互作用,共同调控着肝脏再生这一复杂过程。当前对于肝脏再生机理的认识仍然是一个难题,当中的众多调控过程依然无法加以阐述。鉴于此,本次研究的目的在于筛选肝脏再生过程中新的功能基因,为肝脏再生的机理研究提供新的思路,为开发新的具有肝脏保护作用的药物,提供理论依据。本文的工作基础是运用基因芯片技术,得到了小鼠CCl4损伤模型下,基因组转录的变化情况。通过这一结果,我们从在肝损伤恢复过程中上调的基因中选取了四个基因的表达产物作为研究对象,分别是趋化因子CCL2及其受体CCR2,钙离子结合蛋白S100A6和S100A11。研究计划是首先将小鼠CCL2,S100A11和S100A6的基因构建到pcDNA3.1质粒真核表达载体上,在小鼠CCl4损伤模型下,通过肌肉电转染方法,对CCL2,S100A11和S100A6在肝再生过程中的功能进行初步鉴定;然后,CCR2作为CCL2的主要受体,对其进行抗体阻断实验,来验证CCR2在肝再生过程中的作用;接下来,构建CCL2,S100A11和S100A6原核表达载体、诱导表达、纯化以及生物学活性检测,希望得到具备活性的重组蛋白后,将其运用于小鼠CCl4损伤模型实验中,研究其在肝脏再生过程的功能。通过质粒电转染,我们发现在肝损伤小鼠在恢复过程中,CCL2能进一步加深小鼠肝脏的损伤,使血清中转氨酶活力升高,肝细胞异常的硕大,脂肪化严重并伴有胆囊的萎缩和胃的肿大,病理学上确认是有严重的炎症。在发现CCL2的表达有可能会阻碍肝再生的恢复后,决定利用抗CCR2的多克隆抗体阻断CCL2与CCR2的结合,来判断CCR2在肝脏再生过程中是否有作用。我们利用pGEX原核表达载体表达,并纯化得到了CCR2氨基端的前1-55个氨基残基,即CCR2的第一个膜外区。将得到的蛋白用于制备多克隆抗体,抗体经纯化后,并用Western blot和ELISA测定了效价,用于抗体阻断实验。实验结果发现,实验组与对照组的小鼠血清中转氨酶的活力没有差别,通过HE染色和免疫组织化学染色也没有发现比较大的差异,说明对于CCR2的第一个膜外区的抗体阻断,可能对于肝脏的再生没有作用。将CCL2的基因重组到pET-28表达载体,采用蛋白原核表达的办法来表达CCL2。经过诱导,表达的重组蛋白在包涵体中。先对蛋白进行纯化,再将纯化获得的蛋白收集液进行复性,最终获得了非常纯的CCL2重组蛋白。为下一步利用具有活性的重组蛋白进行动物实验,检测CCL2对于肝损伤模型下,小鼠肝脏再生的恢复情况打下了基础。在S100A11的质粒电转染实验中,发现在肝损伤后的第4天,实验组的血清中转氨酶活力远比对照组要高,而且通过HE染色发现在注射四氯化碳后的第4天,相比于对照组,实验组小鼠的大部分肝细胞呈空泡状,细胞形态不规则,脂肪化十分严重,再进行PCNA免疫组织化学的染色,发现在注射四氯化碳后的第4天,实验组仍还有很多细胞在进行增殖,而对照组仅有少量的细胞在进行增殖,说明其肝损伤后的恢复要好于实验组。由此我们得出,S100A11能抑制肝脏的再生过程,减慢肝细胞的增殖。通过将S100A11的基因重组到pET-28表达载体上,经诱导表达,重组蛋白多集中在超声破碎以及离心后的上清中,于是将上清过His亲和柱,通过纯化,得到了比较纯的S100A11蛋白,便于进行下一步的研究。在S100A6的质粒电转染实验中,实验组比对照组的小鼠对于四氯化碳毒性的耐受能力要强。另外,我们发现在肝损伤后的第4天和第7天,实验组的小鼠的血清中,转氨酶的活力要比对照组低。在HE染色中发现在第7天,实验组小鼠的肝脏相比对照组,恢复得更好,而在PCNA的免疫组织化学染色的结果也发现,在第7天,实验组的小鼠肝脏中,肝细胞基本上结束了增殖,即肝脏已经恢复到了正常水平,但在对照组中,仍有PCNA阳性的细胞存在,说明肝脏仍处于恢复阶段。所以我们得出S100A6可能对于肝脏损伤后的恢复有帮助作用。通过以上的研究,我们初步确认了趋化因子CCL2,钙离子结合蛋白S100A11和S100A6在肝再生过程中具有调节作用。同时,我们表达纯化了CCL2和S100A11重组蛋白,并构建了S100A6的原核表达载体,为下一步研究这些蛋白在肝脏再生过程的具体作用和机理研究提供了基础,也为肝脏再生整个信号网络调控的理论研究提供了新的证据,同时也将趋化因子家族和钙离子结合蛋白家族与肝脏再生的调控连接在了一起,为肝脏再生提供了一个新的研究思路。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 肝脏再生
• 1.2 肝脏再生的分子机理
• 1.3 肝脏再生模型
• 1.4 趋化因子CCL2 及其受体CCR2
• 1.5 钙离子结合蛋白S100A11 和S100A6
• 1.6 论文的主要研究内容和创新点
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 常用试剂
• 2.2 实验仪器与设备
• 2.3 常用溶液的配制
• 2.3.1 常规溶液
• 2.3.2 SDS 碱裂解法大量制备质粒DNA 相关溶液
• 2.3.3 蛋白电泳相关溶液
• 2.3.4 Western blot 相关溶液
• 2.3.5 ELISA 相关溶液
• 2.3.6 HE 染色和免疫组织化学相关溶液
• 2.4 方法
• 2.4.1 肝脏组织总RNA 的提取
• 2.4.2 肝脏组织总cDNA 的合成
• 2.4.3 检测RT-PCR 的cDNA 质量
• 2.4.4 基因的克隆和表达载体的构建
• 2.4.5 大量制备高纯度的pcDNA3.1 以及插入外源基因的pcDNA3.1 重组质粒
• 2.4.6 高纯度质粒中内毒素的清除以及内毒素含量的测定
• 2.4.7 小鼠肝损伤模型
• 2.4.8 质粒电转染方法
• 2.4.9 小鼠血液和肝脏样品的采集
• 2.4.10 组织包埋程序
• 2.4.11 组织石蜡切片的制作
• 2.4.12 常规HE 染色步骤
• 2.4.13 PCNA 免疫组织化学
• 2.4.14 血清中谷丙转氨酶（ALT）活力的测定
• 2.4.15 重组蛋白的小量原核表达
• 2.4.16 重组蛋白的大量诱导表达
• 2.4.17 蛋白裂解处理方案
• 2.4.18 Glutathione Sepharose 48 纯化GST 融合蛋白及用Thrombin 酶解融合蛋白
• 2.4.19 Glutathione Sepharose 48 树脂的回收
• 2.4.20 Bradford 法测蛋白溶液浓度
• 2.4.21 多克隆抗体的制备
• 2.4.22 抗体纯化
• 2.4.23 Western blot 检测抗体效价
• 2.4.24 酶联免疫吸附实验（ELISA）
• TM Nichel Affinity Gel 亲和纯化融合蛋白'>2.4.25 His-Select^TM Nichel Affinity Gel 亲和纯化融合蛋白
• 2.4.26 包涵体的变性和复性
• 第三章 结果
• 3.1 CCL2 及其受体CCR2 在肝再生过程中的作用
• 3.1.1 RT-PCR 获得cDNA
• 3.1.2 CCL2 真核表达载体的构建和鉴定
• 3.1.3 pcDNA-CCL2 质粒小鼠电转染实验结果
• 3.1.4 CCR2 氨基端55 个氨基残基多肽的原核表达载体的构建
• Δ1-55 的原核表达及纯化'>3.1.5 CCR2_Δ1-55的原核表达及纯化
• Δ1-55 多克隆抗体的制备'>3.1.6 CCR2_Δ1-55多克隆抗体的制备
• Δ1-55 抗体阻断的实验结果'>3.1.7 CCR2_Δ1-55抗体阻断的实验结果
• 3.1.8 CCL2 原核表达载体的构建
• 3.1.9 CCL2 的原核表达及纯化
• 3.2 S100A11 在肝再生过程中的作用
• 3.2.1 S100A11 真核表达载体的构建和鉴定
• 3.2.2 pcDNA-S100A11 质粒小鼠电转染实验结果
• 3.2.3 S100A11 原核表达载体的构建
• 3.2.4 S100A11 的原核表达及纯化
• 3.3 S100A6 在肝再生过程中的作用
• 3.3.1 S100A6 真核表达载体的构建和鉴定
• 3.3.2 pcDNA-S100A6 质粒小鼠电转染实验结果
• 3.3.3 S100A6 原核表达载体的构建
• 第四章 讨论
• 第五章 结论和展望
• 5.1 本文研究总结
• 5.2 课题研究展望
• 参考文献
• 附录
• 附录1 克隆基因的开放阅读框序列
• 附录2 各种试剂盒使用步骤
• 附录3 pcDNA3.1，pGEX-4T-2 和pET-28 质粒图谱
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表或录用的论文