论文摘要
骨质疏松是一种以骨量减少,骨的微观结构退变,骨脆性增加而易于发生骨折的一种全身性代谢性骨骼疾病,随着社会人口的老龄化,骨质疏松症的发病率呈逐年上升趋势。骨质疏松性骨折是骨质疏松症最严重的并发症,因其组织学基础差、破骨细胞功能活跃、骨形成能力相对不足,治疗也更加困难,严重威胁着中老年人群的健康和生存质量。探索行之有效的药物干预措施可降低骨质疏松行性骨折发病率,提高治愈率,改善该类人群的生存质量。他汀类药物是竞争性3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A （HMG-CoA）还原酶抑制剂,能够降低肝内胆固醇生物合成,临床上主要用于治疗高脂血症。自1999年首次有研究报道他汀类药物的成骨潜能后,包括辛伐他汀在内的他汀类药物促进骨形成的作用逐渐成为诸多学者关注和研究的对象,研究结果因实验设计的不同而结论各异。临床试验和体内给药的动物实验中对辛伐他汀的促骨形成作用存在争议,有研究表明辛伐他汀可提高正常大鼠骨转换水平,另有研究发现辛伐他汀可部分阻止骨质疏松动物模型去卵巢大鼠骨量的丢失,但对骨质疏松性骨折的作用尚有待深入研究。相对于体内实验中的诸多争议,体外实验中,包括辛伐他汀促进骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells, BMSCs）或前成骨细胞系的成骨分化的作用比较肯定,但具体作用机制尚不明确。本研究通过建立骨质疏松性骨折大鼠模型及体外培养BMSCs并给予辛伐他汀干预,从体内体外不同角度探讨辛伐他汀促骨形成作用及其作用机制。第一部分辛伐他汀对骨质疏松大鼠股骨骨折愈合的影响虽然有部分研究认为骨质疏松对骨折愈合无显著不良影响,但多数基础和临床试验都证实骨质疏松对骨折愈合有延迟作用。辛伐他汀虽表现出一定的促骨形成作用潜能,但在辛伐他汀对骨折愈合作用的报道中以正常（非骨质疏松性骨折）居多,通过口服给药干预骨质疏松性骨折（模型）的研究未见报道。双侧卵巢切除大鼠是公认的骨质疏松动物模型,本研究中也以此卵巢切除大鼠的骨折模型为干预对象。目的：本实验拟通过制作双侧卵巢切除大鼠股骨中段骨折建立骨质疏松性骨折模型,并给予辛伐他汀干预,探讨骨质疏松对骨折愈合影响及辛伐他汀对骨质疏松性骨折愈合的作用及机制。方法：12周龄雌性Sprague-Dawley大鼠40只随机分成5组,每组8只：假手术（Sham）组；卵巢切除（OVX）组；正常骨折对照组（N+Fx）；卵巢切除+骨折+生理盐水对照（OVX+Fx+V）组；卵巢切除+骨折+辛伐他汀（OVX+Fx+SIM）组。除Sham、N+Fx组外,其余各组大鼠行双侧卵巢切除术,N+Fx组、OVX+Fx+V组与OVX+Fx+SIM组于卵巢切除术4周后制作骨折模型,采用右股骨中段横行开放性骨折,克氏针固定；OVX+Fx+SIM组给予辛伐他汀灌胃干预（20mg/kg/d）, N+Fx组OVX+Fx+V组给等量生理盐水。Sham组和OVX组于术后4周处死,取大鼠右侧股骨标本,行双能X线骨密度仪（DEXA）测量右股骨骨密度；其余三组于骨折后6周处死,完整取出右侧股骨。标本进行CR摄片并评分、DEXA测量右股骨整体骨密度（total bone mineral density, tBMD）、中段骨密度（middle bone mineral density, mBMD）和远端骨密度（distal bone mineral density, dBMD）,将组织于10%中性甲醛缓冲固定液中固定48 h,后经常规脱钙、石蜡包埋并制备5um切片,HE染色,镜下行组织学观察。结果：1骨质疏松模型建立：卵巢切除后4周,OVX组BMD显著低于Sham组（P<0.05）,体重明显高于Sham组,差异均有统计学意义（P<0.05）。2各骨折组右股骨骨密度：OVX+Fx+V组、OVX+Fx+SIM组tBMD、mBMD和dBMD均显著低于N+Fx（P<0.05）, OVX+Fx+SIM组各段BMD均高于OVX+Fx+V组,但差异无统计学意义（P>0.05）。3 CR摄片：骨折后6周,OVX+Fx+SIM组与OVX+Fx+V组整体愈合情况较N+Fx组差,多数标本骨折线清晰,X线评分均显著低于N+Fx组,OVX+Fx+SIM组高于OVX+Fx+V组,但差别无统计学意义。4组织学观察：N+Fx组大鼠骨痂组织更为成熟,可见板层骨形成,OVX+Fx+V组、OVX+Fx+SIM组软骨成分比例明显较高,均未见板层骨形成。结论：1大鼠双侧卵巢切除4周后骨量显著低于正常大鼠,适于制作骨质疏松性骨折模型。2骨质疏松大鼠骨折愈合较正常延迟,辛伐他汀可部分阻止去卵巢大鼠骨量丢失并表现出一定的促进骨折愈合的作用趋势,但效果并不显著。第二部分辛伐他汀促进大鼠BMSCs成骨分化BMSCs具有多向分化潜能,在特定条件下可以向多种细胞包括成骨细胞分化,因此在组织工程、细胞移植及基因治疗等领域倍受重视。在BMSCs向不同方向分化过程中会伴有特异性标志蛋的表达和功能活性的变化,碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, ALP）在成骨细胞分化过程中活性特异性增高,细胞外基质矿化小结形成等特异性生物学行为也是鉴定成骨细胞功能的重要参照。作为降脂药物之一,辛伐他汀治疗骨质疏松、骨折及骨缺损等的作用潜能已成为近来研究的热点。目的：本实验旨在通过采用全骨髓培养法体外诱导培养大鼠BMSCs并予以辛伐他汀干预,探讨该培养方法获取BMSCs的可行性以及辛伐他汀对BMSCs成骨分化及细胞外基质矿化能力的影响。方法：取6周龄雄性SD大鼠股骨、胫骨骨髓,进行细胞培养,并于第3天开始成骨诱导培养（维生素C50ug/ml,β-磷酸甘油钠10umol/ml）,同时实验组（SIM）加入辛伐他汀（1×10-7mol/L）,对照组（V）加入等量溶剂。细胞培养的第14天提取第2代细胞,采用流式细胞术检测细胞表面标志抗原CD45、CD11b的表达率对培养的大鼠BMSCs进行鉴定；对爬片细胞进行碱性磷酸酶（ALP）染色、及细胞裂解液上清ALP比活性观察细胞成骨分化能力；第21天行Von Kossa染色观察细胞外基质矿化能力。结果：1流式细胞术检测结果：第2代细胞表面标志抗原CD45阳性表达率6.75±1.26%,CDl1b阳性表达率为7.91±0.96%。2 ALP染色及比活性检测：细胞培养的第14天SIM组ALP阳性细胞比例、比活性显著高于V组（P<0.05）。3 von Kossa染色：第21天SIM细胞外基质矿化能力明显强于V组。结论：1大鼠全骨髓培养法可获得BMSCs,在一定诱导条件下可向成骨细胞分化,表现出成骨分化及细胞外基质矿化能力。2辛伐他汀可上调ALP的表达和活性,促进BMSCs的成骨分化,并表现出更强的细胞外基质矿化能力。第三部分辛伐他汀干预下大鼠BMSCs基因表达谱先前研究证实辛伐他汀具有促进体外培养的BMSCs向成骨细胞分化的作用,但具体作用机制尤其是基因水平的分子机制尚不明确,目前对辛伐他汀干预BMSCs分化方向的作用机制的研究仅限于个别基因,如BMP-2、cbfal（成骨分化）,LPL、PPARγ2（成脂分化）。基因芯片技术的发展使同时大批量观察基因表达水平成为可能,通过对敏感基因的筛查分析建立相关干预条件下基因表达谱,不仅可全面分析作用机制,更为下一步研究确定干预靶标提供了依据。目的：本实验旨在通过基因芯片筛选辛伐他汀作用下成骨定向诱导分化的BMSCs差异表达基因,建立相关基因表达谱,以期进一步明确辛伐他汀促进BMSCs成骨分化的作用机制,为后续研究及其早日应用于相关骨病的治疗提供理论依据和参考。方法：取6周龄雄性SD大鼠股骨、胫骨BMSCs进行培养,第3天改用成骨诱导培养基,同时实验组（SIM）加入辛伐他汀（1×10-7mol/L）,对照组（V）加入等量溶剂。第21天提取RNA,测定OD260/280值并凝胶电泳检测RNA纯度质量；纯化后逆转录合成cDNA,荧光标记后与大鼠全基因组寡核苷酸芯片（G4130A）杂交、扫描后筛选出差异表达的基因,取同批次RNA行Real-time RT-PCR检测,验证部分差异表达基因mRNA的表达。结果：1 RNA纯度及质量：凝胶电泳示RNA18s、28s条带清晰,无杂带,OD260/280值分别为2.14（V）、2.15（SIM）,提示RNA质量完好,可用于基因芯片检测。2在22575个基因中,共检测出502个差异表达基因,包括脂类代谢、炎性因子、转录因子、细胞信号传导等,其中ALP1、TGFβ1、OCN、DLX5、Axin2、BMP-2、IBSP、MMP13等多个因子与成骨分化相关。3 Real-time PCR验证：经验证多个基因表达所检测基因TGF-β1、BMP-2、MMP-13、OCN、ALP,两组间表达差异与芯片结果基本一致。结论：基因芯片分析提示辛伐他汀能够调控成骨分化过程中大鼠BMSCs包括脂类代谢、炎性因子、物质合成与转运以及与成骨分化相关基因的表达,其促进BMSCs向成骨细胞分化的作用机制可能与此有关。
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