论文摘要
本研究通过PCR扩增、T-A克隆测序分析牦牛的功能基因，与GenBank中其它物种相应基因核苷酸序列、氨基酸序列进行了比对分析，构建分子系统进化树。取得了一系列有价值的研究成果：（1）牦牛GH基因全序列长为2847bp，由5个外显子和4个内含子组成，cDNA序列全长为654bp，GH前体氨基酸数目为217个，信号肽和成熟肽由26和191个氨基酸组成。其中牦牛GH基因全序列与普通牛同源性为98％，与水牛、山羊、绵羊同源性分别为97％、94％、93％。UPGMA、NJ和MP法构建分子系统树显示，牦牛与普通牛的亲缘关系最近，其次为水牛、山羊和绵羊、红鹿；在所测序列中，物种间该基因核苷酸变异类型包括转换、颠换和插入，以转换最为常见。（2）序列分析结果表明，牦牛H-FABP基因由4个外显子和3个内含子组成，cDNA序列全长为402bp，前体氨基酸数为133个。4个外显子大小分别为73bp、173bp、102bp和54bp；3个内含子大小分别为3460bp、1892bp、1495bp。不同物种间在核苷酸和氨基酸序列上均有较高的保守性。牦牛与普通牛、绵羊、山羊、猪、人、鸡、大鼠、小鼠、斑马鱼各物种在H-FABP基因编码区核苷酸序列间同源性大小分别为99．8％、97．8％、97．0％、92．8％、88．8％、83．3％、83．1％、76．4％、68．7％；相应的氨基酸序列间同源性大小为100％、96．9％、96．9％、92．4％、88．7％、85．7％、85．7％、77．4％、69．9％。用H-FABP基因编码区核苷酸序列构建物种间分子进化树，结果表明，牦牛与上述各物种的系统聚类结果不仅与动物学分类一致，也同樊宝良、欧江涛以及用HSL基因对牦牛与其它物种间的系统进化聚类结果基本吻合。（3）在牦牛H-FABP基因序列中，重复序列所占比率为13．07％。在内含子Ⅰ含有5个重复元件，包括SINE／Artiodactyls元件、SINE／MIR3元件、SINE／Bov-tA1元件各1个以及2个SINE／MIR元件；内含子Ⅱ无重复元件；内含子Ⅲ有3个重复元件，其中SINE／MIR元件、LINE／L2元件、SINE／Artiodactyls元件各1个。SINEs短重复序列所占比率为11．85％，哺乳动物分散性重复序列MIRs比率为6．44％。LINEs所占比率小于SINEs元件，为1．22％。其中，LINE1、BovB／Art2、L3／CR1重复元件以及LTR类反转录元件和DNA转座子元件在牦牛该基因区域中不存在。（4）牦牛与普通牛、瘤牛、水牛、人、猪、大鼠、小鼠7个物种HSL基因外显子Ⅰ部分核苷酸序列间保守性较高，同源性大小依次为99．8％、99．6％、97．4％、90．6％、88．4％、83．5％、82．3％。相应氨基酸序列间保守性更高，同源性分别为100％、100％、98．2％、94．0％、92．2％、89．8％、89．8％。牦牛与各物种该基因部分核苷酸序列间碱基变异类型主要表现为碱基转换和颠换，无碱基插入和缺失发生；序列间单碱基变异位点大多出现在同一位点，符合分子进化的中性学说。（5）利用HSL基因外显子Ⅰ部分核苷酸序列进行比对分析并构建系统进化树，结果表明，普通牛和瘤牛首先聚为一类，再分别与牦牛、水牛、猪、人聚类，最后与大鼠、小鼠聚为一类。该聚类结果与动物学上的分类结果一致。研究表明，牦牛、普通牛和瘤牛三个物种间的遗传距离远小于它们各自与水牛这一物种的遗传距离，三者之间的亲缘关系也相对于它们与水牛间的亲缘关系较近，故将牦牛、普通牛和瘤牛划分在同一个属—牛属（Bos），而将水牛划分在另一个属更为合理。（6）牦牛HSP72基因序列全长为1926bp，无内含子，共编码641个氨基酸；牦牛HSP72基因和HSP72蛋白与普通牛、猪、人相比存在着一定差异。从HSP72基因到HSP72蛋白的不同层次上对牦牛、普通牛、猪、人等物种进行聚类分析的结果，同进化的理论和其他基因的分析结果一致。（7）九龙牦牛、大通牦牛、巴州牦牛和三江黄牛的EPO基因均由5个外显子和4个内含子组成，但其大小和碱基组成差异较大。九龙牦牛、大通牦牛、巴州牦牛和三江黄牛的该基因大小分别为3284bp、3281bp、3260bp和3245bp。核苷酸序列比较结果来看，大通牦牛与巴州牦牛、九龙牦牛、三江黄牛的同源性依次为99．7％、99．6％、99．5％，巴州牦牛与九龙牦牛、三江黄牛的同源性依次为99．5％、99．4％，九龙牦牛与三江黄牛的同源性为99．4％，表明牦牛品种间及牦牛与三江黄牛种间在该基因核苷酸水平上均具有较高的保守性，但也具有一定的差异，这种差异是否与牦牛适应高海拔低氧生态环境有关，值得深入研究。（8）大通牦牛、巴州牦牛、九龙牦牛及三江黄牛EPO氨基酸序列比较结果表明，大通牦牛与巴州牦牛、九龙牦牛、三江黄牛的同源性依次为100％、99．5％、99．5％，巴州牦牛与九龙牦牛、三江黄牛的同源性均为99．5％，九龙牦牛与三江黄牛的氨基酸序列同源性高达100％。说明牦牛品种间及与三江黄牛种间在EPO氨基酸序列上更为保守，但也存在差异，这种差异是否会影响不同物种EPO的结构和表达，进而对不同物种适应高海拔、低氧生态环境的能力产生影响，有待进一步深入研究。应用EPO基因构建大通牦牛、巴州牦牛、九龙牦牛、三江黄牛、普通牛、猪、人等物种的分子系统进化树，表明系统树能反映各物种间的亲缘及进化关系。
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