梅、中国李PGIP基因及其启动子的克隆和梅PGIP基因转化烟草的研究

论文摘要

多聚半乳糖醛酸酶是真菌侵染植物时分泌的第一个酶。它因能降解植物细胞壁，从而促成了真菌对植物的侵入和植物发病。多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIP）是存在于多种植物细胞壁中的一种糖蛋白，它能专一性识别真菌内切多聚半乳糖醛酸酶并抑制其活性，在一定程度上抑制真菌对植物细胞壁的降解。此外，两者相互作用产生的大片段细胞壁多糖降解物能够激发植物防卫系统，引发植物自身防卫反应的发生。因此该蛋白在植物抵制真菌病害的发生中发挥着重要作用。本实验以梅和中国李两种果树为材料，克隆了PGIP基因及其上游的启动子序列，并通过相关软件，对它们的结构和功能进行了分析。同时构建了PGIP基因的高效表达载体，进行了烟草的转化研究。现将主要研究结果汇总如下：1．利用梅叶片基因组DNA为模板，PGIP基因保守序列为引物，通过PCR克隆到了梅PGIP基因的全长DNA序列（Genbank登录号：AY764131）。2．利用中国李叶片基因组DNA为模板，PGIP基因保守序列为引物，通过PCR克隆到了中国李PGIP基因的全长DNA序列（Genbank登录号：DQ200847）。3．梅、中国李PGIP基因序列分析结果表明，它们与杏、桃、马哈利樱桃PGIP基因序列一致度为95％-97％，包含有完整的编码区域和典型的内含子拼接位点。其翻译的蛋白质序列含有抗病蛋白所共有的10个亮氨酸重复序列。分子进化树中，两条基因序列与杏、桃、马哈利樱桃的PGIP基因序列位于同一类，而与山楂、草莓、柑橘类、苹果等中的PGIP基因序列相距较远。梅、中国李PGIP基因核酸序列之间存在46个碱基差异，其蛋白序列中有15个氨基酸存在差异，但都不在PGIP的功能位点上。4．以梅叶片基因组DNA为模板，通过梅PGIP基因5’端的外显子区反向设计引物，PCR扩增到了一条1311bp的片段（Genbank登录号：DQ364056）。结构分析后发现，该片段中包含了一段长1038bp的PGIP基因启动子序列。5．以中国李叶片基因组DNA为模板，李PGIP基因5’端的外显子区为引物，通过PCR扩增，获得了一条2338bp的片段（Genbank登录号：DQ364055）。结构分析后发现，该片段中包含了一段长1870bp的启动子序列。6．梅、中国李PGIP基因启动子的BLAST分析结果表明，NCBI中无相似核酸序列与该启动子区段相匹配。对GenBank、EMBL和DDBJ三个核酸数据库中收录的139条PGIP基因相关信息进行分析后，发现目前三个数据库中均无PGIP基因启动子序列注释。对已经完成测序的模式植物拟南芥和水稻基因组注释进行了分析，仅在拟南芥基因组中发现了PGIP基因启动子的注释。进一步对梅、中国李、拟南芥三者中的PGIP基因启动子进行序列相似性分析，结果表明，拟南芥与梅、中国李PGIP启动子差异非常大，几乎没有相似的区段；而梅、中国李PGIP启动子却非常相似。7．启动子顺式调控元件分析表明，梅、中国李启动子序列中均包含有TATA框、CAAT框等基本的基因组成型调控元件；同时还包含有三类抗病相关元件，分别是SEBFCONSSTPR10A元件、GT1元件、WBBOXPCWRKY1元件。表明PGIP基因的表达与病原菌侵染、机械损伤和水杨酸诱导有关。8．构建了在梅PGIP基因的植物双元表达载体，并将其导入根癌农杆菌LBA4404中，然后转化烟草，获得了25株hyg抗性苗。其中的13株抗性苗PCR检测结果表明，12株扩增出了目的条带。再从中取7株进行Southern杂交检测，发现7个株系中均整合了目的基因。进一步的RT-PCR检测结果表明，7个转基因株系均发生了转录，内含子的切割部位与预测的相同。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词
• 引言
• 上篇 文献综述
• 第一章 植物抗病分子机制研究进展
• 1 植物诱导抗病性的遗传基础和分子机制
• 2 植物诱导抗病中的多种防卫反应
• 2.1 产生活性氧（ROS）
• 2.2 植物抗病相关蛋白的产生
• 2.3 植保素的产生
• 2.4 细胞壁物质的沉积与氧化交联
• 2.5 过敏反应
• 3 诱导植物抗病反应的激发子
• 3.1 生物激发子
• 3.2 非生物激发子
• 4 植物诱导防卫反应中的信号转导
• 4.1 水杨酸依赖途径
• 4.2 茉莉酸（JA）乙烯（ET）途径
• 4.3 两种信号传导途径诱发的抗性强弱的平衡和调节
• 4.4 参与植物诱导防卫反应的其他信号分子及其作用
• 4.4.1 一氧化氮
• 2+'>4.4.2 Ca²⁺
• 4.4.3 β-氨基丁酸（BABA）
• 4.4.4 寡糖
• 5 结束语
• 第二章 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白研究进展
• 1 PGIP的生化性质
• 2 PGIP的生物学功能
• 3 PGIP含量分布的差异与植物抗性强弱的关系
• 4 植物PGIP基因及其表达特性
• 5 NCBI数据库中收录的PGIP现况分析
• 5.1 NCBI核酸数据库中收录的PGIP现况分析
• 5.2 NCBI蛋白数据库中收录的PGIP现况分析
• 6 PGIP在基因工程中的应用
• 7 展望
• 参考文献
• 下篇 研究论文
• 第一章 梅和中国李PGIP基因的克隆及序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 试剂
• 1.3 方法
• 1.3.1 模板DNA的制备
• 1.3.2 DNA的定性与定量检测
• 1.3.3 PCR引物的设计
• 1.3.4 PGIP基因的扩增
• 1.3.5 PGIP基因PCR产物的回收、纯化、连接、转化与测序
• 1.3.5.1 PCR产物的回收与纯化
• 1.3.5.2 感受态大肠杆菌DH5α的制备
• 1.3.5.3 PGIP基因回收纯化PCR产物的连接
• 1.3.5.4 连接产物的转化及重组质粒的抗生素、α互补筛选
• 1.3.5.5 PGIP基因的测序
• 1.3.6 测序结果的生物信息学分析
• 2 结果与分析
• 2.1 PGIP基因的克隆与测序
• 2.2 PGIP基因的序列分析
• 2.2.1 PGIP基因及其编码蛋白的结构分析
• 2.2.2 PGIP基因序列聚类分析
• 2.3 梅、李PGIP基因序列比较
• 2.4 梅、李PGIP基因的登录
• 3 讨论
• 第二章 梅、中国李PGIP基因上游启动子的克隆及调控元件分析
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 试剂
• 1.3 寡聚核苷酸序列
• 1.3.1 PGIP基因上游调控区染色体步行的接头序列
• 1.3.2 接头引物
• 1.3.3 PGIP基因特异性引物
• 1.4 方法
• 1.4.1 梅、李基因组总DNA的提取
• 1.4.2 启动子的克隆
• 1.4.3 PCR产物的克隆及测序
• 2 结果与分析
• 2.1 连接介导的启动子PCR扩增
• 2.2 PGIP基因启动子PCR扩增产物的克隆与测序
• 2.3 启动子BLAST分析
• 2.4 启动子调控元件分析
• 2.5 PGIP基因启动子的登录
• 3 讨论
• 第三章 农杆菌介导梅PGIP基因转化烟草的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 植物材料和试剂
• 1.1.2 菌种和质粒
• 1.1.3 烟草组织培养培养基
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 PGIP基因的PCR扩增
• 1.2.2 含有PGIP目的基因的植物双元表达载体的构建
• 1.2.2.1 PCR产物的回收与纯化
• 1.2.2.2 P-Super1300+和PGIP基因的双酶切
• 1.2.2.3 P-Super1300+和PGIP基因双酶切产物的回收和纯化
• 1.2.2.4 上述双酶切回收产物的连接
• 1.2.2.5 对连接产物中的目的基因进行测序
• 1.2.3 构建好的植物双元表达载体转化感受态根癌农杆菌LBA4404
• 1.2.3.1 感受态农杆菌LBA4404的制备
• 1.2.3.2 细菌中质粒DNA的制备（采用碱裂解小量制备法）
• 1.2.3.3 根癌农杆菌LBA4404的转化及保存
• 1.2.4 烟草叶盘法遗传转化
• 1.2.5 转基因植株的鉴定
• 1.2.5.1 烟草基因组DNA的制备
• 1.2.5.2 烟草植株总RNA的制各
• 1.2.5.3 转基因植株的PCR检测
• 1.2.5.4 转基因植株的Southern-blot分析
• 1.2.5.4.1 Southern杂交药品的制备
• 1.2.5.4.2 探针制备
• 1.2.5.4.3 探针的标记
• 1.2.5.4.4 基因组DNA的酶切及电泳
• 1.2.5.4.5 转膜
• 1.2.5.4.6 预杂交及杂交
• 1.2.5.4.6.1 预杂交及杂交温度
• 1.2.5.4.6.2 预杂交及杂交程序
• 1.2.5.4.7 洗膜
• 1.2.5.4.8 免疫鉴定
• 1.2.5.5 转基因植株的RT-PCR检测
• 1.2.5.5.1 反转录反应
• 1.2.5.5.2 PCR反应
• 1.2.5.5.3 RT-PCR产物的回收、克隆、PCR检测与测序
• 2 结果与分析
• 2.1 PGIP基因的PCR扩增
• 2.2 含有PGIP目的基因的植物双元表达载体的构建
• 2.3 烟草叶盘法遗传转化
• 2.4 转基因植株的鉴定
• 2.4.1 转基因烟草植株基因组DNA的质量检测
• 2.4.2 转基因烟草PCR鉴定
• 2.4.3 转基因烟草Southern杂交检测
• 2.4.4 转基因烟草植株总RNA的提取与检测
• 2.4.5 转基因烟草植株RT-PCR检测
• 2.4.6 转基因烟草植株RT-PCR产物的测序
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 创新点
• 附录目录
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 附录4
• 附图1
• 博士期间发表论文
• 致谢