小菜蛾两个乙酰胆碱酯酶的基因干扰分析

论文摘要

乙酰胆碱酯酶（acetylcholinestrase, AChE, EC3.1.1.7）是神经冲动传导中的一种关键酶,是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标。其主要存在于胆碱能神经末梢的突触间隙,尤其是运动神经终端突触后膜的皱褶中聚集较多。其经典功能是水解胆碱能神经突触处的神经递质乙酰胆碱（ACh）而保持神经突触传导的正常进行。除此之外,AChE还具有诱导轴突、突触的形成和分化,参与细胞迁移和相互作用、细胞粘附和凋亡,促进造血细胞形成和淀粉样蛋白聚集等非经典功能。目前,已在许多昆虫中克隆发现两个乙酰胆碱酯酶基因。在大多数农业害虫中,acel编码的乙酰胆碱酯酶被认为是杀虫剂的主要作用靶标。而在双翅目的部分昆虫中,只存在ace2基因,分析认为ace1在进化中丢失,其功能被ace2取代。RNA干扰（RNA interference, RNAi）是外源或者细胞内源性产生的一些短片段的双链RNA,在生物体内诱导靶基因mRNA的特异性降解来阻断体内特定基因的表达,产生相应功能的缺失。大量实验证明,RNAi现象广泛存在于生物界中,是生物抵御病毒侵染和阻断转座子的古老防御机制之一。随着研究的不断深入,RNAi的机制正在被逐步阐明,而同时作为功能基因组和基因治疗研究中的有效工具,RNAi也越来越为人们所重视。本文通过RNA干扰技术沉默小菜蛾的两个乙酰胆碱酯酶基因表达,分析其基因功能并研究RNA干扰技术在害虫防治中的作用。1.通过显微注射荧光标记的siRNA,将siRNA导入二龄小菜蛾腹背板内。24小时后荧光显微观察发现,siRNA可以穿过小菜蛾脑血屏障到达头部,证实siRNA可以进入小菜蛾的中枢神经系统。同时,与对照相比注射siRNAs后不同时间的试虫死亡率明显上升,表明RNA干扰具有一定的效果。2.定量结果显示,si Pxace-1处理72小时后的ace1mRNA表达量被下调90%以上,而si Pxace-2处理后的ace2mRNA表达量被下调近50%。AChE酶蛋白比活力结果显示,与阴性对照组siNC相比,注射siPxace-1、siPxace-2及siPxace-1&2后96小时的乙酰胆碱酯酶的活力分别下降了64%、21%和47%,达到部分沉默的效果。上述结果证明通过活体体腔注射法,外源siRNA能够有效沉默小菜蛾体内ace基因的表达。3.取食行为实验结果显示,干扰px-ace1后会显著影响小菜蛾的爬行速度和取食,而px-ace2被干扰后的影响不显著,同时还发现处理组的小菜蛾幼虫出现种内自残现象。干扰px-ace1后,小菜蛾的体长和体重明显较对照组织小。而干扰px-ace2（?）寸体长体重的影响不显著。结果表明,干扰px-ace1比干扰px-ace2更加显著地影响小菜蛾的生长发育状况,si Pxace-1试虫发育受阻率高达50%。进一步的表型观察发现干扰小菜蛾的乙酰胆碱酯酶还影响腹足的发育。干扰px-ace1后出现腹足一侧不发育、腹足完全不发育、腹足和头部发育均受阻等不同程度的畸形虫。4.用RNA干扰手段将ace基因沉默后,通过浸叶法对各处理组进行毒死蜱和多杀菌素毒力测定。与对照相比,干扰乙酰胆碱酯酶的处理组试虫死亡率明显上升,在48小时达到极显著的差异。结果表明,干扰乙酰胆碱酯酶后,小菜蛾对毒死蜱和多杀菌素的敏感性显著提高。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略语
• 第一章 文献综述
• 1 乙酰胆碱酯酶的研究进展
• 1.1 乙酰胆碱酯酶概述
• 1.2 昆虫中多个乙酰胆碱酯酶的存在
• 1.3 乙酰胆碱酯酶的经典和非经典功能
• 2 RNA干扰的研究概况
• 2.1 RNA干扰的研究历程及现状
• 2.2 RNA干扰机制
• 2.3 系统性RNA干扰
• 2.4 RNA干扰的应用及展望
• 3 小菜蛾的研究简介
• 3.1 小菜蛾的生物学特性
• 3.2 小菜蛾的发生与为害特点
• 3.3 小菜蛾的抗药性
• 4 本研究的目的和意义
• 5 研究内容和研究路线
• 第二章 小菜蛾两个乙酰胆碱酯酶基因的RNA干扰
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 试虫来源及饲养
• 1.2 主要试剂和仪器
• 1.3 小菜蛾siRNA序列
• 1.4 活体显微注射
• 1.5 注射后死亡率数据统计
• 2 结果与分析
• 2.1 显微注射法将siRNA导入试虫体内
• 2.2 siRNA导入试虫体内后死亡率分析
• 3 讨论
• 第三章 RNA干扰后小菜蛾乙酰胆碱酯酶基因的表达水平分析以及酶活力检测
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 主要试剂和仪器
• 1.3 总RNA提取和cDNA合成
• 1.4 实时荧光定量PCR模板质量检测
• 1.5 定量PCR引物
• 1.6 小菜蛾ace基因的定量PCR分析
• 1.7 小菜蛾乙酰胆碱酯酶活力测定
• 1.8 统计方法
• 2 实验结果
• 2.1 荧光定量PCR产物熔解曲线分析及扩增效率的一致性分析
• 2.2 RNA干扰后目标基因mRNA的qRT-PCR检测
• 2.3 RNA干扰后的乙酰胆碱酯酶活力分析
• 3 讨论
• 第四章 RNA干扰后小菜蛾的表型变化观察和行为学观察
• 摘要
• 1 实验方法
• 1.1 取食行为实验
• 1.2 小菜蛾表型观察、体长体重统计
• 2 结果与分析
• 2.1 取食行为实验结果
• 2.2 注射后不同时间体长体重统计分析
• 2.3 注射后小菜蛾表型观察
• 3 讨论
• 第五章 RNA干扰后小菜蛾对有机磷农药及多杀菌素的敏感性
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 主要试剂与仪器
• 1.3 室内毒力测定方法
• 1.4 酶活力测定方法
• 2 结果与分析
• 2.1 干扰后小菜蛾对毒死蜱的敏感性
• 2.2 干扰后小菜蛾对多杀菌素的敏感性
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附录：攻读硕士学位期间学术论文的发表情况
• 致谢