鸡传染性支气管炎病毒HN99株的分离鉴定及生物学特性研究

论文摘要

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis, IB)是由冠状病毒科、冠状病毒属的鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus, IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病。上世纪30年代在美国爆发以来,现在已经成为世界各地流行的主要禽病。IBV是单股RNA病毒,该病毒基因可由于点突变和重组而发生变异,因此IBV的血清型较多,已达30余种之多,常见的有M41、Conn、Iowa97、Gray、Hotle、JMK、Clark333、SE17、Florida、Arkanass99和Australian T等,不同血清型毒株之间仅有部分或无交叉保护作用,从而给本病的防治带来困难。我国目前虽然已广泛使用IB疫苗,但由于IBV的易变异型,IB仍然呈高度流行趋势,尤其是在已免疫鸡群中也常常爆发IB,造成严重的经济损失。近年来,河南各地养鸡场在进行了IB的常规免疫程序后,仍爆发了严重的疑似IB的传染性疾病,给全省的养鸡业造成严重的损失。为查明引发该类疾病的确切病因,找出确切的病原,我们对河南某发病鸡场疑似IB的典型病例展开了病原的实验室分离和鉴定工作,并对其生物学特性进行了研究。无菌采集发病鸡的气管、肺脏、肾脏等组织,采用鸡胚盲传观察病毒对鸡胚的致病作用,病毒盲传至第2代后鸡胚出现死亡和侏儒胚;尿囊液经磷酸酯酶C处理后能够凝集1%的鸡红细胞;病毒纯化后经外源病毒检测,无外源病毒污染;将病毒盲传至E8代时,病毒的EID50逐渐增强到106.5/0.1 mL;病毒能够干扰NDV在鸡胚中的增殖;病毒可致SPF雏鸡发病,引起肾脏肿大、花斑肾、尿酸盐沉积等肾脏病变;电镜下可见到直径90～105 nm的冠状病毒粒子;理化特性测定表明,该毒株对乙醚和氯仿敏感,耐酸不耐碱,对热敏感。初步证实分离的病毒为鸡传染性支气管炎病毒,命名为HN99株。对HN99株的Sl基因进行克隆与测序,使用DNAStar软件进行序列分析。结果显示,HN99株与常见的M41、Gray、Holte、H120、H52、Conn等毒株的Sl基因同源性不高,分别为79.4%、72.7%、77.4%、79.1%、78.3%,而与T株的同源性高达99.6%,遗传进化关系也揭示HN99株与T株的亲缘关系较近,而与其它毒株的关系较远。证实HN99株为一新的IBV变异株。利用病毒中和试验和HI试验对HN99株进行了血清分型,结果表明HN99株不属于常见的M41、Conn、Gray等血清型,而HB、JS、SD等地方分离株则属于HN99株血清型,表明HN99株血清型具有一定的地域覆盖性;交叉保护试验证实了血清分型的结果;用HN99株和M41株制备的二价疫苗免疫试验鸡后,不仅产生了较高的抗体水平,而且能够同时抵御HN99株血清型和M41株血清型毒株的攻击,表明HN99株有较好的免疫原性,为利用地方分离株进行IB的防制奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• 文献综述
• 1 传染性支气管炎概述
• 2 IB 病原学研究进展
• 2.1 IBV 的分类地位及形态结构
• 2.2 IBV 的理化特性
• 2.3 IBV 的血凝特性
• 2.4 IBV 的培养特性
• 2.5 IBV 的致病性与临床型
• 2.6 IBV 的分型
• 2.6.1 免疫保护型
• 2.6.2 抗原型
• 2.6.3 基因型
• 3 IBV 分子生物学研究进展
• 3.1 IBV 的基因组
• 3.2 IBV 的主要结构蛋白及功能
• 3.3 IBV 的复制机制
• 3.4 IBV 的转录机制
• 3.5 IBV 的遗传变异
• 4 IB 疫苗的研究进展
• 4.1 弱毒活疫苗
• 4.2 灭活疫苗
• 4.3 亚单位疫苗
• 4.4 核酸疫苗
• 4.5 活载体疫苗
• 引言
• 试验一 鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要仪器设备
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 种蛋及SPF 鸡
• 1.1.4 常用溶液的配制
• 1.1.5 病料
• 1.2 方法
• 1.2.1 病料样品的处理
• 1.2.2 病毒的分离培养
• 1.2.3 病毒的纯化与增殖
• 50)的测定'>1.2.4 鸡胚半数感染量(EID₅₀)的测定
• 1.2.5 红细胞凝集试验
• 1.2.6 NDV 干扰试验
• 1.2.7 致病力试验
• 1.2.8 理化试验
• 1.2.9 电镜观察
• 2 结果与分析
• 2.1 病毒的分离
• 2.2 病毒的纯化
• 2.3 病毒EID50 的测定
• 2.4 红细胞凝集试验
• 2.5 NDV 干扰试验
• 2.6 对SPF 鸡的致病力试验
• 2.7 理化试验
• 2.8 电镜观察
• 3 结论与讨论
• 试验二 传染性支气管炎病毒51 基因的克隆和序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 毒株与菌种
• 1.1.2 质粒和工具酶
• 1.1.3 试剂盒及其它试剂
• 1.1.4 主要仪器
• 1.1.5 常用溶液及培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物的设计与合成
• 1.2.2 病毒RNA 的提取
• 1.2.3 S1 基因片段的RT-PCR 扩增
• 1.2.4 S1 基因RT-PCR 产物的克隆与鉴定
• 1.2.5 S1 基因的核苷酸序列测定
• 1.2.6 S1 基因的核苷酸及所编码的氨基酸序列分析
• 1.2.7 S1 基因的核苷酸系统进化关系分析
• 2 结果与分析
• 2.1 S1 基因的RT-PCR 扩增
• 2.2 S1 基因的克隆及酶切鉴定
• 2.3 S1 基因的序列测定及分析
• 2.4 S1 基因同源性分析
• 2.5 S1 基因遗传进化关系分析
• 3 结论与讨论
• 试验三 鸡传染性支气管炎病毒血清学和免疫学特性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 毒株、抗原和抗体
• 1.1.2 种蛋及SPF 鸡
• 1.1.3 主要仪器设备
• 1.1.4 主要试剂
• 1.1.5 常用溶液的配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 微量血球凝集抑制（HI）试验
• 1.2.2 HI 抗原的制备
• 1.2.3 HI 抗原特异性试验
• 1.2.4 IBV 阳性血清的制备
• 1.2.5 HI 交叉试验
• 1.2.6 交叉中和试验
• 1.2.7 HN99 株免疫特性研究
• 2 结果与分析
• 2.1 HI 抗原制备
• 2.2 HI 抗原特异性
• 2.3 阳性血清的制备
• 2.4 HI 交叉试验
• 2.5 交叉中和试验
• 2.6 灭活疫苗的制备
• 2.7 疫苗抗体水平测定
• 2.8 免疫交叉保护
• 3 结论与讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 英文摘要