苏云金杆菌aiiA基因的克隆及其表达产物抗细菌性病害研究

论文摘要

植物致病性病原菌最主要为革兰氏阴性细菌,其自身代谢产物N-酰基高丝氨酸内酯（N-acyl-homoserine lactones, AHL）,是一类革兰氏阴性细菌群体致病性应答系统中的关键信号分子。当菌群中AHL累计到一定浓度后,就能激活病原菌致病基因表达,产生致病性并出现各种相关的病症。因此降低病原菌AHL的浓度将成为防治这些病害的关键。目前已从芽胞杆菌等克隆出aiiA基因,并发现其表达的产物可以降解AHL,从而大大减弱致病菌的危害。本研究克隆了来自苔藓、土壤和植物叶片中分离的苏云金芽胞杆菌中aiiA基因,即aiiA-B15、aiiA-B19、aiiA-S2、aiiA-S9、aiiA-P4、aiiA-P28,并对其编码的AHL-Lactonase蛋白进行了生物信息学分析。结果表明这些蛋白均为弱亲水性蛋白,含有3个典型的保守结构域,均属于β-内酰胺酶超家族的结构域。从计算机模拟的三级结构可以看出,AHL-Lactonase蛋白中的His-104、His-106、Asp-108、His-109、His-169、Asp-191、Tyr-194、His-235在空间结构上相互靠近,形成一个较为致密的与甘油结合的结构域,是重要的活性中心。6个α螺旋位于外侧,形成活性中心的表面保护层。通过比较16S rRNA基因和AHL-Lactonase蛋白的进化树,表明aiiA基因编码的AHL-Lactonase蛋白与Bt物种的进化并不同步,在该物种的进化过程中aiiA基因可能早于物种的分化;aiiA基因不能作为Bt物种进化的遗传标记。这些预测结果的综合应用不仅为aiiA基因表达、蛋白纯化等后续研究提供了大量宝贵的信息,并为改造AHL-Lactonase酶学特性,提高AHL- Lactonase的抗病能力等工作提供有价值的参考。本研究首先选用了pGEX-4T-3表达载体,构建重组质粒pGEXaiiA-B15,获得BL21（DE3）- pGEXaiiA-B15工程菌。表达条件的优化表明,在0.6 mmol/L IPTG、30℃下诱导3 h,蛋白的表达量最大,但绝大多数为包涵体。接着利用pET-29a构建了pET29a-aiiA融合表达载体,制备E.coli BL21 （DE3）-pET29a-aiiA工程菌,在0.8 mmol/L IPTG、20℃,25 h下诱导表达,获得了54.4μg/mL可溶性AHL- lactonase-B15蛋白,并采用亲和层析的方法纯化AHL-lactonase-B15。AHL- lactonase-B15对胡萝卜软腐欧文氏杆菌抗病性实验表明,AHL-lactonase-B15具有较好的抗病性,明显抑制了马铃薯的腐烂。值得注意的是,BL21（DE3）-pET29a-aiiA工程菌诱导表达后超声破壁的上清液样品也具有很好的水解AHL的活性和抗病性。这表明AHL-lactonase-B15在浓度较低并存在很多杂蛋白的情况下仍然有较强的活性。这也提示了AHL-lactonase-B15具备作为新型高效无公害的生物农药的潜能,具有进一步深入研究价值。AHL-lactonase-B15酶学特性表明,AHL- lactonase-B15酶促反应最适温度在40℃左右,最适pH约为8。以上研究结果为AHL-Lactonase蛋白质工程研究、微生物抗细菌病害基因工程育种、大规模发酵生产及其实际生产应用提供理论依据,对提高果蔬品质和产量、减少化学农药污染,实现经济效益、社会效益和生态效益的同步增长,具有重要的理论意义和实际应用价值。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 革兰氏阴性细菌的群体感应系统
• 1.1.1 革兰氏阴性细菌群体感应系统的信号分子
• 1.1.2 AHL 类信号分子的合成
• 1.1.3 几种革兰氏阴性细菌群体感应类型
• 1.1.3.1 海洋费氏弧菌（Vibrio fischeri）群体感应系统
• 1.1.3.2 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）群体感应系统
• 1.1.3.3 胡萝卜软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora）群体感应系统
• 1.1.3.4 根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）群体感应系统
• 1.2 革兰氏阳性细菌的群体感应系统
• 1.2.1 革兰氏阳性细菌群体感应系统的概况
• 1.2.2 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）群体感应系统
• 1.3 细菌种间的群体感应系统
• 1.3.1 细菌种间群体感应系统的概况
• 1.3.2 哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）群体感应系统
• 1.4 群体感应在生物防治中的作用
• 1.5 AHL 降解酶的研究进展
• 1.5.1 AHL-内酯酶
• 1.5.1.1 AHL-内酯酶概述
• 1.5.1.2 AHL-内酯酶结构特性
• 1.5.1.3 AHL-内酯酶活性检测
• 1.5.2 AHL-酰胺酶
• 1.6 本研究的目的和意义
• 第2章 苏云金芽胞杆菌 aiiA 基因的克隆和生物信息学分析
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.1.1 质粒和菌株
• 2.1.1.2 试剂
• 2.1.1.3 缓冲液
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 引物设计
• 2.1.2.2 质粒DNA 的制备
• 2.1.2.3 基因组DNA 的制备
• 2.1.2.4 aiiA 基因的克隆
• 2.1.2.5 16S rRNA 基因的克隆
• 2.1.2.6 基因测序与数据处理
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 克隆aiiA 基因的Bt 菌株的种属分析
• 2.2.2 aiiA 基因的PCR 扩增和分子克隆
• 2.2.3 AHL-Lactonase 结构分析
• 2.2.3.1 AHL-Lactonase 理化表征分析
• 2.2.3.2 AHL-Lactonase 的同源性分析
• 2.2.3.3 AHL-Lactonase 亲水性分析
• 2.2.3.4 AHL-Lactonase 活性结构域预测
• 2.2.3.5 AHL-Lactonase 空间结构分析
• 2.2.3.6 AHL-Lactonase 进化树分析
• 2.3 小结与讨论
• 第3章 含 aiiA 基因工程菌的表达及其抗病活性分析
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.1.1 菌株与质粒
• 3.1.1.2 试剂
• 3.1.1.3 培养基
• 3.1.1.4 缓冲液
• 3.1.1.5 仪器
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.2.1 表达载体构建
• 3.1.2.2 外源基因的诱导表达及表达条件优化
• 3.1.2.3 GST-AHL-Lactonase 包涵体的制备与变性及复性
• 3.1.2.4 可溶性表达AHL-Lactonase-B15 的分离纯化
• 3.1.2.5 AHL-Lactonase 活性的检测
• 3.1.2.6 AHL-Lactonase 对胡萝卜软腐欧文氏杆菌抗病性测定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 GST-AHL-Lactonase 包涵体的表达
• 3.2.1.1 诱导时间对GST-AHL-Lactonase 表达的影响
• 3.2.1.2 培养温度对GST-AHL-Lactonase 表达的影响
• 3.2.1.3 IPTG 浓度对GST-AHL-Lactonase 表达的影响
• 3.2.1.4 GST-AHL-Lactonase 变性复性
• 3.2.1.5 复性后GST-AHL-Lactonase 活性检测
• 3.2.1.6 复性后GST-AHL-Lactonase 的抗病性测定
• 3.2.2 AHL-Lactonase 的可溶性表达
• 3.2.2.1 IPTG 浓度对AHL-Lactonase-B15 表达的影响
• 3.2.2.2 诱导表达温度和时间对AHL-Lactonase-B15 表达的影响
• 3.2.2.3 镍离子亲和层析纯化结果
• 3.2.2.4 AHL-Lactonase-B15 活性的检测
• 3.2.2.5 AHL-Lactonase-B15 抗病性测定
• 3.3 小结与讨论
• 第4章 AHL-Lactonase-B15 酶动力学研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.1.1 菌株
• 4.1.1.2 试剂
• 4.1.1.3 仪器
• 4.1.2 实验方法
• 4.1.2.1 AHL-Lactonase-B15 的分离纯化及纯度鉴定
• 4.1.2.2 AHL-Lactonase-B15 蛋白含量的测定
• 4.1.2.3 AHL-Lactonase-B15 活力测定方法
• 4.1.2.4 温度对AHL-Lactonase-B15 活力影响测定的方法
• 4.1.2.5 pH 对AHL-Lactonase-B15 活力影响测定的方法
• 4.1.2.6 动力学参数Km 值确定的方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 底物含量与HPLC 峰面积的关系
• 4.2.2 温度对AHL-Lactonase-B15 活力的影响
• 4.2.3 pH 对AHL-Lactonase-B15 活力的影响
• 4.2.4 AHL-Lactonase-B15 动力学参数
• 4.3 小结与讨论
• 第5章 苏云金芽胞杆菌 LLB19 发酵培养基配方优化及发酵 培养基对 AHL 的降解作用
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.1.1 菌株
• 5.1.1.2 培养基
• 5.1.2 实验方法
• 5.1.2.1 发酵培养条件
• 5.1.2.2 芽胞量测定
• 5.1.2.3 发酵培养基的优化
• 5.1.2.4 发酵培养基对AHL 影响分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 单因子实验
• 5.2.1.1 碳源单因子
• 5.2.1.2 氮源单因子
• 5.2.2 Plackett-Burman 设计法筛选培养基中影响发酵液芽胞产量的重要因子
• 5.2.3 爬坡路径方法确定发酵培养基重要影响因子的最适浓度范围
• 5.2.4 响应面分析法确定发酵培养基最佳浓度配方
• 5.2.5 模型验证
• 5.2.6 发酵培养基对AHL 影响分析
• 5.3 小结与讨论
• 第6章 总结与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢