表达猪瘟病毒石门株E0抗原重组鸡痘病毒载体的构建及免疫效果试验

论文摘要

猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的猪的高度致死性、接触性传染病,对全球的养猪业危害严重,被世界动物卫生组织（OIE）列为A类传染病。猪瘟病毒为具有囊膜的RNA病毒,病毒粒子含有3种囊膜糖蛋白,即E0（或Erns）、El和E2,其中E0参与病毒诱导机体产生中和抗体,而且编码E0的核酸序列保守程度高,因而也可作为预防猪瘟的一种亚单位疫苗。灭活苗和活病毒疫苗多是目前针对猪瘟病毒最有效的一些疫苗。但是由于传统疫苗接种后免疫猪与自然感染猪无法区分,而标记疫苗能够解决这一问题。本研究将猪瘟病毒石门株的E0基因插入真核表达载体鸡痘病毒FV282中表达,为猪瘟病毒的活载体疫苗提供基础。1.进行鸡痘病毒重组转移载体的构建。运用一系列分子生物学方法,将E0基因连接到转移载体FPV-pSY中,通过酶切,PCR扩增,以及测序鉴定正确,证明E0基因已经成功插入转移载体FPV-pSY,重组转移载体构建成功。用Wizard Purifection Plasmid质粒纯化试剂盒进行大量纯化,以备转染鸡胚成纤维细胞用。2.重组痘病毒的筛选和纯化。用纯化的FPV-pSY-E0质粒转染已经感染及鸡痘病毒FV282的鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast ,CEF）,获得的FV282-E0经过10轮蓝斑筛选和纯化获得稳定表达猪瘟病毒石门株E0抗原蛋白的重组痘病毒。经过PCR扩增,SDS-PAGE蛋白电泳和Western blot检测,证实该重组鸡痘病毒载体可以表达猪瘟病毒石门株E0抗原,为下一步免疫效果的评价提供了材料。3.重组痘病毒疫苗免疫效果的研究。首先是Balb/c鼠的免疫试验,用重组鸡痘病毒免疫3次后,ELISA检测血清抗体滴度高达1∶4096。证明该重组鸡痘病毒可以诱导动物产生较高滴度针对猪瘟病毒的抗体效价。进一步进行本体动物猪的保护试验,结果该重组鸡病毒的保护率为75%,可以对猪产生较强的保护力,为进一步生产猪瘟鸡痘病毒活载体疫苗奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 猪瘟病毒及其疫苗研究进展
• 1.1 猪瘟病毒及基因组
• 1.1.1 E0 蛋白
• 1.1.2 E2 蛋白
• 1.1.3 E1 蛋白
• 1.1.4 C 蛋白
• 1.2 猪瘟的感染过程
• 1.3 猪瘟的诊断
• 1.3.1 临床诊断
• 1.3.2 实验室诊断
• 1.4 流行病学
• 1.5 猪瘟免疫失败原因分析
• 1.5.1 猪瘟疫苗原因
• 1.5.2 免疫程序不合理
• 1.5.3 免疫操作原因
• 1.5.4 对免疫接种认识的错误
• 1.5.5 猪群健康状况
• 1.5.6 其他因素
• 1.6 猪瘟疫苗研究进展
• 1.6.1 基因工程亚单位疫苗
• 1.6.2 病毒活载体疫苗
• 1.6.3 DNA 疫苗
• 1.7 禽痘病毒研究进展
• 1.7.1 禽痘病毒的分子生物学特性
• 1.7.2 禽痘病毒表达载体的优越性
• 1.7.3 筛选方法的选择及注意要点
• 1.7.4 重组禽痘病毒的研究进展
• 1.7.5 重组禽痘病毒疫苗的安全性、应用前景及其存在的问题
• 第二章 表达猪瘟病毒石门株E0 抗原的重组鸡痘病毒载体的构建
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 载体构建
• 2.1.3 鸡胚成纤维细胞的制备
• 2.1.4 FV282 疫苗种毒的制备
• 2.1.5 转染和病毒筛选
• 2.1.6 重组鸡痘病毒的蛋白电泳（SDS-PAGE）及 Western blot 检测
• 2.1.7 重组鸡痘病毒（FV282-E0）的PCR 检测
• 2.1.8 重组鸡痘病毒蚀斑试验
• 2.2 结果
• 2.2.1 重组鸡痘病毒转移载体的构建
• 2.2.2 E0 重组鸡痘病毒的筛选与纯化
• 2.2.4 重组鸡痘病毒SDS-PAGE 电泳和Western blot 检测
• 2.2.5 重组鸡痘病毒蚀斑试验
• 2.3 讨论
• 第三章 重组鸡痘病毒的免疫效果试验
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验动物
• 3.1.2 重组鸡痘病毒载体
• 3.1.3 免疫Balb/c 小鼠程序及方法
• 3.1.4 猪的免疫攻毒程序及方法
• 3.1.5 体温检测
• 3.1.6 ELISA 检测
• 3.2 结果
• 3.2.1 Balb/c 小鼠免疫试验结果
• 3.2.2 攻毒试验结果
• 3.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附 录
• 致 谢
• 作者简介