论文摘要
紫花苜蓿是一种优良的多年生豆科牧草,在我国干旱半干旱地区农牧业发展及生态建设中发挥着重要作用。但是,大多数紫花苜蓿品种耐盐抗旱能力较弱,在盐渍或灌溉不足条件下种植难获高产难。因此,选育具有较强耐盐性和抗旱性的紫花苜蓿新品种,是发展我国干旱半干旱地区紫花苜蓿草产业的迫切需求。传统抗逆育种周期长,且容易受到各种内抗逆基因资源的限制,利用生物技术培育具有较强耐盐抗旱性的转基因紫花苜蓿新品种,对提高我国西北干旱半干旱地区紫花苜蓿人工草地产量、节约灌溉以及利用盐荒地具有重大的现实意义。目前已证实植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白和H+-焦磷酸酶（H+-PPase）编码基因的超表达可显著提高植物的耐盐性和抗旱性。但以往研究所用基因多来自于模式植物、作物和盐生植物,且以单基因转化为主,这可能会影响此类基因在改良植物抗逆性中的作用效果。本实验室已从具有极强抗旱性的多浆旱生植物霸王（Zygophyllum xanthoxylum）中克隆了液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因ZxNHX和H+-PPase基因ZxVP1-1,并构建了其双价表达载体。本论文研究在前期工作基础上,采用根癌农杆菌介导法将ZxNHX和ZxVP1-1基因聚合转入紫花苜蓿品种“新疆大叶”,获得共表达ZxNHX和ZxVP1-1的转基因株系,最后检测转基因紫花苜蓿的耐盐性和抗旱性,并评估其田间综合性状,主要结果如下：1、首次利用旱生植物霸王液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因ZxNHX和H+-PPase基因ZxVP1-1对紫花苜蓿进行聚合转化,获得了25个共转化转基因紫花苜蓿株系；PCR分析表明外源基因已经整合转基因紫花苜蓿基因组中；对所得到的所有转基因系列进行RT-PCR分析,发现ZxNHX忽ZxVP1-1基因在转基因系列中都能正确表达,其中2、9、24号株系中2个基因的表达丰度均最高。2、耐盐性和抗旱性分析表明,ZxNHX和ZxVP1-1的共表达增强了转基因紫花苜蓿的耐盐抗旱性。正常条件下,转基因紫花苜蓿植株比野生型植株生长更快；在高盐和水分胁迫下,野生型紫花苜蓿发生萎蔫,生长受限,甚至死亡；而转基因紫花苜蓿植株仍然存活并保持正常生长,其株高、根长和生物量均显著高于野生型。生理测定结果表明：在盐或干旱胁迫下,转基紫花苜蓿比野生型植株在叶和根中积累了更多的Na+、K+和Ca2+,并维持较高的叶片相对含水量和净光合速率。这些结果说明ZxNHX和ZxVP1-1的共表达可能促进了转基因紫花苜蓿细胞中Na+向液泡中的区域化,减轻了其毒害作用,并增强了细胞对其它阳离子的吸收能力,从而使转基因紫花苜蓿能在盐或干旱胁迫下保持较多水分并具有较强的光合能力。3、田间试验表明,共表达ZxNHX和ZxVP1-1的转基因紫花苜蓿在温室和野外大田中的综合性状均优于野生型。在90天的生长过程中,转基因植株较野生型生长更快,光合能力更强,生物量更高。