基因重组大肠杆菌高密度发酵生产类人胶原蛋白及其分离纯化

论文摘要

本文主要研究了基因重组大肠杆菌高密度发酵生产类人胶原蛋白及其分离纯化的过程。考察了三种不同的控氧方式,即葡萄糖反馈、提高罐压、富氧通气;四种不同间歇周期的补氮操作,即每隔25s补加补料氮溶液1.5mL（1.5mL/25s）、18mL/5min、36mL/10min、72mL/20min;诱导条件,即诱导时机、发酵液中乙酸浓度、诱导强度;对细胞生长和目标蛋白（类人胶原蛋白）表达的影响。对细胞生长和类人胶原蛋白表达的动力学、代谢途径通量进行了分析。研究了批量离子交换层析和凝胶过滤层析相结合的方法对类人胶原蛋白进行纯化的控制工艺。结果表明: 1.采用提高罐压的控氧方式控制发酵液中溶解氧在培养过程中维持于20%～30%饱和度,可以使最终的细胞产量达到77.3g·L-1,类人胶原蛋白的表达量为13.9g·L-1,均高于葡萄糖反馈和富氧通气两种控氧方式下的细胞产量和类人胶原蛋白表达量; 2.当补料氮溶液的添加方式为36mL/10min时,最终细胞产量可达到84g·L-1,类人胶原蛋白的表达量为14g·L-1,分别为四种补氮周期操作方式下的最大者; 3.当细胞处于对数生长的中后期时,升温至42℃进行诱导,可使最终的类人胶原蛋白表达量达到10.3g·L-1,要高于当细胞处于对数生长的中期和后期时进行诱导时类人胶原蛋白的表达量; 4.发酵液中代谢副产物乙酸的存在对细胞生长和类人胶原蛋白的表达均可产生非常显著的影响。当发酵液中乙酸钠的添加量为3.0g·L-1时,最终细胞产量和类人胶原蛋白的产量仅为43.3g·L-1和2.0g·L-1,类人胶原蛋白产量仅为不添加乙酸钠时的20%; 5.诱导强度对最终类人胶原蛋白的产量可产生显著的影响。42℃保持时间太短,细胞诱导不够充分;42℃保持时间太长,细胞活性部分丧失,对产物表达产生不利影响。当采用42℃诱导3h后降温至39℃继续诱导5h的策略时,最终的细胞产量和类人胶原蛋白产量分别为78.5g·L-1和

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 综述
• 1 胶原蛋白
• 1.1 胶原蛋白概述
• 1.2 胶原蛋白的结构
• 1.3 胶原蛋白的生物学功能
• 1.4 胶原蛋白的应用
• 1.4.1 化妆品
• 1.4.2 保健品及食品
• 1.4.3 医药及医疗
• 1.4.4 生物医学材料
• 1.4.5 仿生力学
• 1.4.6 研究用途
• 1.5 类人胶原蛋白
• 1.5.1 动物提取胶原蛋白的缺陷
• 1.5.2 基因重组技术生产胶原蛋白的国际研究现状
• 1.5.3 类人胶原蛋白的优势
• 2 高密度发酵
• 2.1 高密度发酵的影响因素
• 2.1.1 营养源
• 2.1.2 生长抑制物
• 2.1.3 氧的供需状况
• 2.1.4 温度
• 2.1.5 pH值
• 2.2 补料-分批发酵的补料方式
• 2.3 微生物反应动力学
• 2.3.1 细胞生长动力学
• 2.3.2 底物消耗动力学
• 2.3.3 产物形成动力学
• 3 代谢通量分析
• 3.1 代谢通量（MFA）分析方法
• 3.2 大肠杆菌生长和表达外源蛋白的初级代谢相关途径的代谢通量分析
• 4 蛋白质的分离提取
• 4.1 蛋白质纯化依据
• 4.2 蛋白质沉淀
• 4.3 离子交换层析
• 4.4 凝胶过滤层析
• 5 本研究的目的、意义及内容
• 5.1 目的与意义
• 5.2 实验内容及拟解决的问题
• 参考文献
• 第二章 实验材料与方法
• 1 菌种
• 2 试剂
• 2.1 种子培养基
• 2.2 发酵培养基和补料培养基
• 2.3 主要试剂
• 3 主要仪器和设备
• 4 实验方法
• 4.1 种子培养
• 4.2 补料-分批培养
• 4.2.1 不同控氧方式对发酵的影响
• 4.2.2 周期操作对发酵的影响
• 4.3 产物的粗分离
• 4.4 批量离子交换层析
• 4.5 凝胶过滤层析
• 5 分析方法
• 5.1 细胞生长
• 5.2 细胞浓度
• 5.3 葡萄糖浓度
• 5.4 乙酸含量
• 2-R的测定'>5.5 NH₂-R的测定
• 5.6 质粒稳定性
• 5.7 细胞活性检测
• 5.8 类人胶原蛋白表达量
• 5.9 总蛋白含量的测定
• 5.10 类人胶原蛋白的检测
• 5.10.1 定性测定
• 5.10.2 定量测定
• 参考文献
• 第三章 控氧方式对细胞生长和类人胶原蛋白表达的影响
• 1 控氧方法
• 1.1 反馈调控
• 1.2 增加罐压
• 1.3 富氧通气
• 2 结果与讨论
• 2.1 不同控氧方式对细胞生长的影响
• 2.1.1 细胞密度和比生长速率
• 2.1.2 细胞得率系数和乙酸生成
• 2.2 不同控氧方式对目标蛋白表达的影响
• 3 结论
• 参考文献
• 第四章 周期操作对细胞生长类人胶原蛋白表达的影响
• 1 周期操作对细胞质粒稳定性的影响
• 2 周期操作对细胞生长的影响
• 3 周期操作对细胞活性的影响
• 4 周期操作对类人胶原蛋白表达的影响
• 5 结论
• 参考文献
• 第五章 诱导条件的优化
• 1 诱导时机对类人胶原蛋白表达量的影响
• 2 乙酸含量对类人胶原蛋白表达量的影响
• 3 诱导强度对类人胶原蛋白表达量的影响
• 4 结论
• 参考文献
• 第六章 高密度发酵的动力学研究
• 1 实验数据
• 2 分批培养阶段
• 3 补料培养阶段（诱导前）
• 3.1 模型Ⅰ（ Monod方程）
• 3.2 模型Ⅱ（Contois方程）
• 3.3 模型Ⅲ
• 4 诱导阶段
• 4.1 模型Ⅰ（部分相关模型）
• 4.2 模型Ⅱ（带有产物抑制的细胞生长和产物表达模型）
• 5 结论
• 参考文献
• 第七章 高密度发酵表达类人胶原蛋白的代谢通量分析
• 1 代谢网络的确定
• 1.1 代谢网络的选择原则
• 1.2 碳源初级代谢网络的确定
• 2 代谢流的分析方法
• 3 大肠杆菌生长期的代谢流分析
• 3.1 细胞元素组成及结构大分子单体的需求
• 3.2 生物合成前体流量的计算
• 3.3 代谢通量分析
• 3.3.1 诱导前补料培养期不同控氧方式下细胞的代谢通量分析
• 3.3.2 诱导前补料培养期周期操作下细胞的代谢通量分析
• 3.3.3 诱导后不同控氧方式下细胞的代谢通量分析
• 3.3.4 诱导后周期操作下细胞的代谢通量分析
• 4 结论
• 参考文献
• 第八章 类人胶原蛋白的分离纯化
• 1 批量离子交换层析
• 1.1 离子交换树脂及缓冲体系的选择
• 1.2 离子强度的选择
• 1.3 进料蛋白浓度的选择
• 2 凝胶过滤层析
• 3 纯化结果
• 4 结论
• 参考文献
• 攻读博士学位期间取得的科研成果
• 致谢