甲状腺激素促进成年大鼠慢性脑缺血后海马神经祖细胞增殖

论文摘要

研究背景血管性痴呆（Vascular dementia,VaD）是老年期痴呆的主要类型之一,也是引起痴呆最常见的原因,给家庭和社会带来沉重的经济与精神负担。目前已成为老年医学领域中一个研究重点。VaD属于血管性认知障碍（Vascular cognitive impairment,VCI）的一种类型,近年来VCI越来越受到人们的关注,研究表明其可能的机制包括：兴奋性氨基酸毒性,能量衰竭,炎性反应,神经细胞坏死、脱失,神经细胞凋亡等,但具体发病机制尚不十分明确,从而缺乏有效的预防和治疗手段。因此,积极地探索和研究VCI的病因和发病机制已成为当务之急。我们在前期研究中,应用双侧颈总动脉永久性结扎术（2-vessel occlusion,2VO）制备慢性脑缺血致VCI的动物模型,通过测定慢性脑缺血后脑组织甲状腺激素（Thyroid hormones,THs）水平,发现在大鼠学习记忆能力下降的同时,其脑组织甲状腺素（thyroxine, T4）及三碘甲腺原氨酸（3,5,3’-triiodothyronine, T3）的浓度均有所下降,而补充外源性THs的慢性脑缺血大鼠学习记忆能力明显改善,强烈提示血管性认知障碍可能与中枢THs代谢异常有关。但THs通过何种机制影响大鼠脑缺血后的认知功能尚未见报道,因此,非常必要进行进一步的研究,以明确甲状腺激素在血管性认知障碍中的作用。随着成年动物中枢神经系统神经元不能再生的传统观念被打破,有关神经干细胞（Neural stem cells, NSCs）的研究正成为国内外神经科学领域研究的热点并取得了可喜的成果。科学家们发现成年哺乳动物脑中存在两个终生具有神经再生能力的区域,即海马齿状回（Dentate gyrus,DG）的颗粒下层（Subgranular zone,SGZ）和侧脑室外侧壁的室下层（Subventricular zone,SVZ）。SGZ的干细胞迁移至颗粒细胞层,发育形成颗粒细胞,并与海马DG建立突触联系。SVZ的干细胞沿嘴侧迁移至嗅球,经历终末分化后发育成新的中间神经元并进一步建立起神经连接。目前对脑缺血后NSCs的研究主要从两方面进行：神经干细胞移植研究和内源性自体神经干细胞研究。采用NSCs移植治疗脑损伤的实验研究近年来取得了较好的效果,但在移植过程中可能出现细胞混杂现象以及移植后可能存在致瘤性等问题,所以应用于临床还有一段距离。尽管在正常成年动物脑中仅存在低水平神经再生,但内源性NSCs在一定病理条件和神经因子作用下可以增殖活跃,并分化为神经元和神经胶质细胞,参与修复缺失的神经功能。近年来,脑缺血后的神经再生对于认知障碍的改善作用越发引起科学家们的兴趣,而海马作为与学习记忆功能密切相关的脑区在有关神经再生的研究中备受关注。一些研究也发现全脑缺血可以引起SGZ区神经祖细胞增殖数量增加10倍。大多数研究显示祖细胞增殖在缺血后3-4天开始,7-10达到高峰,随后在3-5周恢复正常水平。这种神经再生对认知功能的恢复至关重要,尤其在海马依赖性学习记忆中起重要作用。但是脑缺血所刺激的神经再生只是大脑对缺血的一种代偿机制,远远不能满足大脑所需,因此需要进一步探讨神经再生的调节机制,以便发现促进缺血后神经再生的因素,为认知功能的恢复提供治理新靶点。众所周知,THs在哺乳动物中枢神经系统的发育成熟中起重要作用。其影响脑细胞增殖、分化过程,树突和轴突生长,神经元迁移,髓鞘形成等。在大脑发育关键时期THs缺乏可导致大脑形态缺陷、严重认知障碍和神经损伤,而且往往不可逆转。虽然THs在神经发生上的关键作用已被确认,但对成年动物脑的影响却很少报道。最新资料表明THs可以影响成年哺乳动物中枢神经的再生能力。甲状腺功能低下降低了成年哺乳动物大脑海马齿状回颗粒层祖细胞存活和神经元分化,此现象可随着甲状腺功能的恢复而完全恢复。同时THs缺乏减少了成年大鼠SVZ有丝分裂象,短暂THs供给可以恢复这个过程,提示THs可能直接作用于祖细胞群。这些资料都表明THs可以调节成年动物内源性神经再生。综上所述：慢性脑缺血导致认知功能障碍,这种认知障碍可通过海马区的神经再生得到恢复,但是缺血所刺激的神经再生水平很低,只是大脑的一种代偿机制,远远不能恢复受损的神经功能,因此迫切需要探讨可以促进慢性脑缺血后神经再生的因素。THs可以促进成年动物内源性神经再生,但是在慢性脑缺血的情况下,THs是否可以作为一种调节机制影响神经再生目前尚未见报道。研究目的为了阐明THs对血管性认知障碍的作用及其机制,结合本课题组的前期工作和文献资料,我们提出假说：THs可能通过刺激海马SGZ神经再生,修复受损神经元,进而改善慢性脑缺血所致的认知障碍。因此,本课题拟采用成年大鼠双侧颈总动脉永久性结扎制备慢性脑缺血致血管性认知障碍动物模型,并且设置THs连续7d和即时干预处理,从神经再生角度入手,通过免疫荧光染色方法,观察THs对成年大鼠慢性脑缺血后海马齿状回神经祖细胞增殖的影响,为进一步探讨THs在血管性认知障碍中的作用及机制提供依据。研究方法1.实验动物及分组：健康成年雄性Sprague-Dewle （SD）大鼠30只,体重250-300g。随机分为两组：T3连续7d干预组和即时干预组,各组均15只。各组再随机分为三亚组：假手术组（5只）,慢性脑缺血组（5只）及慢性脑缺血+T3治疗组（简称T3治疗组5只）。饲养环境：标准鼠笼饲养,光照周期12/12h,环境温度22-23℃。2.实验方法：各组大鼠均采用双侧颈总动脉永久性结扎制备慢性前脑缺血模型。大鼠术前24h禁食,不禁水。10%水合氯醛4ml/kg腹腔注射麻醉,动物仰卧固定,被皮,颈前正中切口,钝性分离暴露双侧颈总动脉,埋线结扎,缝合切口,术后正常进食饮水。假手术组只分离颈总动脉不结扎。3.药物注射：T3连续7d干预组：术后第1d T3治疗组经腹腔注射T3 10μg/30g,慢性脑缺血组及假手术组经腹腔注射等量的生理盐水,1次／天,共7d。术后第2d开始所有大鼠均腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU） 50mg/kg,2次/天,连续5天,最后一次注射BrdU 24h后处死。即时干预组：术后第7d T3治疗组死前10h经腹腔注射T3 10μg/30g,慢性脑缺血组及假手术组经腹腔注射等量的生理盐水,8h后,所有大鼠均腹腔注射BrdU（150mg/kg）,2h后处死大鼠。4.灌注、取脑及制备冰冻切片：大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后,经心脏灌注4℃C肝素化生理盐水,再换用4℃C 4%多聚甲醛溶液灌注。迅速开颅标记前囟位置,取出脑组织,再以上述多聚甲醛固定液后固定24h。依次放入4℃15%及30%的蔗糖溶液梯度脱水,分别至脑组织沉入杯底。液氮冰冻脑组织,储存于-80℃冰箱备用。5.免疫组织荧光染色：冰冻切片放入2 mol/L盐酸中37℃30min,0.1 mol/L硼酸溶液（PH=8.5）室温中和10 min,再0.3%Trition-X100溶液37℃30 min,山羊血清37℃封闭1h（不冲洗）。小鼠抗BrdU单克隆抗体（1：100）4℃,湿盒,孵育24h,山羊抗小鼠FITC（1：200）37℃C孵育2h,甘油封片。荧光显微镜采集图像。6.细胞计数：采用20×10倍显微镜视野,对每张切片海马齿状回颗粒细胞下层及门部所有阳性细胞进行计数。每只大鼠选取10张切片,由一对实验设计全盲的观察者计算BrdU+细胞数。SVZ采用40×10倍显微镜视野,每只大鼠选取5张切片,每张切片选取5个相邻的非重叠区域,由一对实验设计全盲的观察者计算BrdU+细胞数。7.统计分析：运用SPSS13.0统计软件进行统计处理。用均数±标准差（x±s）表示,符合正态分布和方差齐性时用单因素方差（one-way ANOVA）分析,进一步组间多重比较采用LSD法。不满足方差齐性时,用Welch法对F值进行校正,进一步多重比较采用Dunnett’s T3法。以P<0.05为差异显著性检验界限。研究结果1.免疫荧光染色结果显示各组大鼠均可见海马齿状回分布BrdU阳性细胞,以颗粒细胞下层最多。细胞核形状大小不一,呈圆形或椭圆形,有的成簇分布,有的单个分布。也可见SVZ背外侧分布BrdU阳性细胞,细胞核形状大小不一,呈圆形或椭圆形。2.T3连续7d干预组：从慢性脑缺血后第1d开始,使用T3连续腹腔注射,发现T3连续7d干预使SGZ BrdU阳性细胞数高于慢性脑缺血组（P=0.005）及假手术组（P<0.001）,差异具有统计学意义；慢性脑缺血组与假手术组比较差异也具有统计意义（P=0.047）。3.T3即时干预组：在慢性脑缺血后第7d,大鼠处死前10h腹腔注射T3,发现10h T3干预也促使SGZ BrdU阳性细胞数高于使用生理盐水干预的慢性脑缺血组（P=0.015）及假手术组（P<0.001）,差异具有统计学意义；慢性脑缺血组与假手术组比较差异也具有统计意义（P=0.007）。4.T3即时干预组对SVZ祖细胞增殖的影响：T310h干预除了对海马的神经祖细胞增殖有影响外,还促使SVZ BrdU阳性细胞数增多,与慢性脑缺血组及假手术组相比差异具有统计学意义（均P<0.001）；慢性脑缺血组与假手术组比较差异也具有统计意义（P<0.001）。研究结论1.慢性脑缺血后使用T3连续7d和短暂10h干预都促进了海马SGZ神经祖细胞增殖,并较单纯慢性脑缺血所刺激的增殖明显增多。2.T310h短暂干预增加了慢性脑缺血后海马SGZ神经祖细胞的增殖,提示T3可能直接作用于海马神经祖细胞群。3.T310h短暂干预也促进了慢性脑缺血后SVZ神经祖细胞的增殖。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料与方法
• 1. 实验动物及饲养条件
• 2. 实验分组
• 3. 动物模型制作
• 4. 主要试剂和仪器
• 5. 药物注射
• 6. 标本取材
• 7. 免疫荧光染色
• 8. 统计分析
• 结果
• 3连续7d干预促进了海马祖细胞增殖'>1. T₃连续7d干预促进了海马祖细胞增殖
• 3即时干预组促进了海马祖细胞增殖'>2. T₃即时干预组促进了海马祖细胞增殖
• 3即时干预也促进了SVZ神经祖细胞增殖'>3. T₃即时干预也促进了SVZ神经祖细胞增殖
• 讨论
• 1. 动物模型的选择
• 2. BrdU标记增殖细胞
• 3. THs调节成年大脑的神经再生
• 全文小结
• 参考文献
• 英文缩略词表
• 致谢
• 统计学证明