喜树色氨酸脱羧酶tdc1基因的克隆及表达分析

论文摘要

喜树（Camptotheca acuminata）是我国特有树种,其次生代谢产物喜树碱（camptothecin, CPT）具有有效抑制DNA拓扑异构酶Ⅰ的功能,是一类具有独特抗癌机理的物质。色氨酸脱羧酶（Tryptophan decarboxylase, TDC）是喜树碱生物合成过程中的关键酶,催化色氨酸脱羧生成色胺,其活性直接影响着喜树碱的生物合成及其相关的代谢过程。本研究以喜树为研究材料,采用分了生物学的方法,在克隆获得色氨酸脱羧酶基因tdcl的基础上,对其进行序列对比分析和原核表达及纯化。同时,借助于喜树碱具有自发荧光的特性,建立了基于荧光检测器的喜树碱含量高效液相色谱测定方法,并对喜树种子萌发过程中喜树碱含量与tdcl表达情况的对应关系进行分析。通过本实验获得了如下的结果：1.成功地从喜树幼苗中克隆喜树tdcl基因,与NCBI上已有喜树tdcl基因在核苷酸序列和氨基酸序列对比的相似性分别为98%和97.41%,且与其他物种对比具有较高的同源性,磷酸吡哆醛结合的位点处的氨基酸序列高度保守,进一步确认我们得到了喜树色氨酸脱羧酶的基因。2.构建tdcl基因的表达载体,确定pET28a-tdcl为表达菌株,最佳原核表达温度为37℃。在该条件下对TDC1蛋白进行原核表达和过柱纯化,纯化得到的TDC1蛋白可作为抗原用于后续抗体制备等研究的基础。3.借助于喜树碱具有自发荧光的特性,建立了基于荧光检测器的喜树碱含量高效液相色谱测定方法。通过对喜树种子萌发过程中喜树碱含量与tdcl表达情况对应关系的分析可以看出,喜树碱的含量和tdcl的表达都是随着喜树种子萌发过程不断变化的。tde1的表达量在第10天达到最大值,相对于喜树碱积累的最高值提前两天,间接证明了色氨酸脱羧酶基因在喜树碱合成过程中的关键作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 喜树简介
• 1.2 喜树碱
• 1.2.1 喜树碱的分布规律
• 1.2.2 喜树碱的生物合成途径
• 1.2.3 喜树碱的生物合成途径中的关键酶
• 1.2.4 喜树碱的理化特性
• 1.2.5 喜树碱的药用价值
• 1.2.6 喜树碱的提取与测定方法
• 1.3 立题依据及目的意义
• 2 喜树tdc1基因的克隆与序列分析
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 实验仪器设备
• 2.1.3 主要实验药品的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 喜树幼苗总RNA提取
• 2.2.2 反转录合成cDNA
• 2.2.3 目的基因片段的PCR扩增与回收
• 2.2.4 特异PCR片段与载体连接
• 2.2.5 质粒DNA的转化、菌落PCR鉴定与质粒提取
• 2.2.6 重组质粒的酶切鉴定
• 2.2.7 目的片段的测序及序列对比分析
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 喜树总RNA的检测和tdc1基因的PCR扩增
• 2.3.2 菌落PCR鉴定
• 2.3.3 pMD18-T-tdc1重组质粒的鉴定
• 2.3.4 目的片段的测序及对比分析
• 2.4 本章小结
• 3 喜树tdc1基因的原核表达及蛋白纯化
• 3.1 实验材料与方法
• 3.1.1 主要实验药品的配制
• 3.1.2 表达载体的构建
• 3.1.3 蛋白质小量表达
• 3.1.4 蛋白质大量原核表达
• 3.1.5 蛋白破碎及纯化
• 3.1.6 SDS-PAGE电泳检测
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 重组质粒目的片段扩增、回收后双酶切结果
• 3.2.2 表达载体的菌落PCR鉴定
• 3.2.3 两种重组表达载体原核表达结果
• 3.2.4 蛋白质纯化
• 3.3 本章小结
• 4 喜树种子萌发过程中喜树碱含量与tdc1表达情况的对应关系
• 4.1 微量样品中喜树碱含量的高效液相色谱测定
• 4.1.1 仪器、材料与试药
• 4.1.2 方法与结果
• 4.2 喜树种子萌发过程中喜树碱含量的变化
• 4.3 喜树种子萌发过程中tdc1表达情况
• 4.3.1 喜树种子的萌发、采样与总RNA提取
• 4.3.2 反转录PCR
• 4.3.3 Real-time PCR测定tdc1表达情况
• 4.3.4 数据分析处理
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 喜树种子萌发过程中喜树碱含量的变化
• 4.4.2 tdc1表达量随喜树种子萌发过程的变化
• 4.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢