论文摘要
研究目的在以往的研究中发现,致病性问号钩端螺旋体（简称钩体）可以在体外诱导小鼠单核巨噬细胞系J774A.1细胞凋亡,但是其具体的凋亡机制还未阐明。本研究的目的是探讨线粒体相关途径在问号钩体诱导巨噬细胞凋亡中的作用。材料与方法（1）建立致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株体外诱导巨噬细胞凋亡的模型:钩体分别与小鼠腹腔巨噬细胞（MPMs）,小鼠单核巨噬样细胞系J774A.1细胞,人单核样细胞系THP-1细胞,共同孵育。采用AnnexinV-FITC和PI双染法,通过流式细胞术检测钩体感染后巨噬细胞凋亡率。（2）透射电镜观察诱导凋亡的巨噬细胞超微结构改变,尤其是线粒体改变。（3）应用活性检测试剂盒测定钩体感染后的巨噬细胞的caspase-8,caspase-9活性变化;非特异性Caspase阻断剂对凋亡的影响;JC-1染色后流式细胞仪和荧光显微镜检测线粒体膜电位（MPT）变化,应用荧光探针DCFH-DA检测细胞内的活性氧（ROS）水平。（4）Western blot分别检测诱导钩体感染后的巨噬细胞在感染不同时间后的线粒体或胞浆成份中的细胞色素C,EndoG,AIF和Smac的表达,同时应用免疫荧光染色法检测相应蛋白的转位。线粒体膜通透性转运孔阻断剂CsA预处理细胞后,对凋亡及线粒体释放蛋白的影响。（5）应用基因芯片技术检测钩体感染后的巨噬细胞的凋亡相关基因Bcl-2家族的mRNA表达水平变化,对表达发生变化的及代表性Bcl-2家族基因的应用Real-time PCR再次确认mRNA水平变化。结果（1）成功建立致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株体外诱导巨噬细胞凋亡的模型,显示问号钩体赖株可诱导3种巨噬细胞均出现不同程度的细胞凋亡,细胞凋亡率在一定范围内,随着感染时间延长和感染菌量的增加而升高。但是感染菌量过高时,细胞凋亡率开始下降,同时细胞坏死率升高。（2）透射电镜结果显示:感染问号钩体后,3种巨噬细胞均出现细胞凋亡的特征,例如染色质浓缩和边缘化,新月形核,细胞空泡化,细胞线粒体肿胀和嵴消失,但是3种被感染巨噬细胞的形态改变之间无明显差异。（3）问号钩体赖株感染3种巨噬细胞后,均可检测到caspase-8活性明显升高,caspase-9活性无明显升高;但是非特异性caspase抑制剂不能完全阻断细胞凋亡。被钩体感染后,3种巨噬细胞线粒体膜电位均随着感染时间的延长而逐渐下降。其中,MPMs的MPT下降幅度大于J774A.1和THP-1细胞。此外,与正常对照细胞相比,被钩体感染的3种巨噬细胞均出现胞内活性氧（ROS）水平升高。（4）Western Blot显示,在问号钩体赖株诱导3种巨噬细胞凋亡的过程中,在MPMs和J774A.1细胞中检测到AIF和EndoG从线粒体释放到胞浆,在THP-1细胞中检测到AIF从线粒体释放到胞浆;但是未检测到细胞色素C和Smac从线粒体释放到胞浆。同时,免疫荧光染色证实钩体感染后AIF或EndoG从线粒体转位到细胞核,从而诱导细胞凋亡的发生。MPT阻断剂可以部分性阻断细胞凋亡,完全阻断AIF或EndoG的释放。（5）线粒体相关的凋亡调节蛋白,Bcl-2家族的mRNA表达水平检测结果显示:钩体感染后3种巨噬细胞后,Bcl-2家族抗凋亡基因Bcl-2,Bcl-XL均无明显变化,但是促凋亡基因Bid,Bik1,Bnip3,Bcor,Bcl-211和Bclaf1在MPMs和J774A.1细胞中表达明显上调,促凋亡基因Bid,Bik1,Bnip3,Bcl-211和Bclaf1在THP-1细胞中小幅上调,其他促凋亡基因无明显变化。结论（1）致病性的问号钩体黄疸出血群赖型赖株可以诱导巨噬细胞凋亡。（2）问号钩体赖株通过caspase依赖的caspase-8途径和线粒体相关的非caspase依赖途径诱导巨噬细胞凋亡。（3）Bcl-2家族在问号钩体赖株诱导细胞凋亡的过程中,一些促凋亡基因mRNA转录水平上调,可能参与凋亡的调控,具体机制有待进一步研究。研究目的研究中国流行的致病性钩端螺旋体（简称钩体）的ompL1基因的特点和分布,OmpL1蛋白的交叉免疫反应性和免疫保护作用。材料与方法将致病性钩体,包括15株中国参考标准株和163株临床分离株,分别提取基因组DNA,PCR法扩增ompL1基因,测序并对核苷酸序列进行比对和分子进化树分析,根据分析结果对ompL1基因进行分型。然后,通过构建原核表达系统,表达并收获重组OmpL1蛋白（rOmpL1）;以纯化的人OmpL1蛋白免疫家兔后获得抗rOmpL1的多克隆抗体。采用Western blot和ELISA法鉴定表达的rOmpL1蛋白的免疫原性和免疫反应性。应用显微镜凝集试验（MAT）检测兔抗rOmpL1抗体的交叉凝集效价,同时应用钩体细胞粘附实验检测此抗体阻断致病钩体赖型赖株的细胞粘附作用。最后,以rOmpL1免疫豚鼠后,检测对不同ompL1基因型别的致病性钩体感染的免疫保护作用。结果全部被检测钩体菌株的基因组DNA都能扩增出ompL1基因。根据钩体标准株的ompL1基因核苷酸序列比对和序列特征的分析结果,将扩增出的ompL1基因分成3型,即ompL1/1,ompL1/2和ompL1/3。通过原核系统表达的3种rOmpL1蛋白与钩体病人血清可以发生免疫反应。MAT试验中,兔抗rOmpL1的3种抗体与不同ompL基因型的钩体菌株之间可以产生广泛和明显的交叉凝集反应。同时,使用rOmpL1蛋白作为包被抗原的ELISA法,进一步验证了3种rOmpL1蛋白与钩体病病人血清样本之间同样可以发生交叉免疫反应。3种兔抗rOmpL1抗血清均能抑制致病性问号钩体赖型赖株粘附J774A.1细胞。此外,3种rOmpL1蛋白免疫豚鼠后,对来自不同ompL1基因类型的致病性钩体的感染具有交叉免疫保护作用。结论中国流行的致病性钩体的ompL1基因可以分成ompL1/1,ompL1/2和ompL1/3三型。外膜蛋白OmpL1是一种具有交叉免疫保护作用的属特异性抗原,可以用于通用新疫苗的研究和对钩端螺旋体病诊断。
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相关论文文献
- [1].犬型钩端螺旋体外膜蛋白OmpL1基因的克隆与序列分析[J]. 中国畜牧兽医 2010(06)
标签：细胞凋亡论文; 问号钩端螺旋体论文; 线粒体相关途径论文; 非依赖途径论文; 家族论文; 交叉免疫反应论文; 交叉免疫保护论文;