硅藻中多不饱和脂肪酸抗肿瘤作用研究

论文摘要

本论文是在硅藻（Nitzschia. laevis）中提取并分离主要生物活性物质多不饱和脂肪酸（PUFAs）的基础上,考察其对肿瘤细胞增殖抑制的作用,并对其抗肿瘤作用及其机理进行了初步研究,从而为研究硅藻中PUFAs的抗肿瘤活性提供理论依据。花生四烯酸（AA）是co-6PUFAs,二十碳五烯酸（EPA）是ω-3PUFAs,以不同比例的AA和EPA检测对不同癌细胞株生长增殖的影响。发现单独使用EPA能够抑制肿瘤细胞的增殖,随着AA的加入,减弱了这种肿瘤增殖抑制作用,EPA最佳作用剂量为75μg/mL,且对人正常肝L-02细胞没有明显的抑制效果。EPA作用HepG-2细胞后经HE、AO/EB染色可见细胞典型凋亡现象。EPA通过提高肿瘤细胞内活性氧的表达水平,从而上调JNK、ERK的磷酸化水平,且这种表达的上调能够被抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）抑制。经过Western blotting法测定凋亡相关蛋白表达,发现EPA诱导HepG-2细胞中Bcl-2蛋白表达的降低,并且还诱导了细胞色素C从线粒体中释放到胞浆中,激活了细胞凋亡的线粒体信号转导途径。且这些变化都受到抗氧化剂NAC、ERK抑制剂PD98059、JNK抑制剂SP600125的抑制。EPA还引起了细胞线粒体膜电位的降低,细胞内钙离子浓度的升高以及cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9表达量的升高,使细胞最终走向凋亡。总之,硅藻中提取的EPA能够抑制肿瘤细胞的生长增殖,是通过受活性氧水平调控的JNK、ERK的磷酸化,引起Bcl-2表达的降低,激活细胞凋亡的线粒体途径,使线粒体膜电位下降,钙离子浓度升高,促进细胞色素C释放释放到细胞浆内,激活Caspase凋亡家族的级联反应,从而最终导致细胞的凋亡

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 多不饱和脂肪酸的结构分类
• 1.1.1 EPA
• 1.1.2 AA
• 1.2 多不饱和脂肪酸的来源
• 1.2.1 动植物来源
• 1.2.2 多不饱和脂肪酸的微藻资源
• 1.2.3 微藻油脂生产优势
• 1.2.4 常见产PUFA的微藻生物
• 1.3 多不饱和脂肪酸的生理功能
• 1.3.1 细胞生长作用
• 1.3.2 多不饱和脂肪酸对血脂、血压、心血管疾病的影响
• 1.3.3 多不饱和脂肪酸的免疫调节作用
• 1.3.4 多不饱和脂肪酸的抗肿瘤作用
• 1.3.5 多不饱和脂肪酸的其他作用
• 1.4 多不饱和脂肪酸的抗肿瘤作用机制
• 1.4.1 影响生物膜的构成和功能
• 1.4.2 改变二十碳烷酸的代谢
• 1.4.3 增加细胞内脂质过氧化
• 1.4.4 抑制癌基因编码蛋白的表达和功能
• 1.4.5 抗肿瘤血管生成
• 1.4.6 抑制癌细胞与内皮细胞粘附
• 1.5 细胞凋亡
• 1.5.1 细胞凋亡形态学变化以及生物化学变化
• 1.5.2 细胞凋亡的的过程和机理
• 1.5.3 线粒体与细胞凋亡
• 1.5.4 MAPK家族与细胞凋亡
• 1.5.5 ROS与细胞凋亡
• 1.5.6 细胞周期与细胞凋亡
• 1.6 细胞凋亡与抗肿瘤
• 1.7 本课题研究的意义和主要内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 藻种
• 2.1.2 细胞株
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 仪器与设备
• 2.1.5 主要溶液及培养基
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 硅藻培养及样品制备
• 2.2.2 细胞培养与传代
• 2.2.3 细胞凋亡检测
• 2.2.4 凋亡信号通路研究
• 2.2.5 免疫印迹
• 3 结果与讨论
• 3.1 硅藻中AA和EPA的提取纯化检测结果
• 3.2 EPA和AA对癌细胞生长增殖的影响
• 3.2.1 不同比例EPA和AA对MCF-7细胞株生长增殖的影响
• 3.2.2 不同比例EPA和AA对BEL-7402细胞株生长增殖的影响
• 3.2.3 不同剂量EPA对三种不同癌细胞株生长增殖的影响
• 3.2.4 EPA对HepG-2和正常肝细胞L-02不同作用时间的影响
• 3.3 细胞凋亡的形态学观察及细胞周期变化
• 3.3.1 HE染色观察细胞形态
• 3.3.2 吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）双染检测细胞凋亡
• 3.4 凋亡信号通路研究
• 3.4.1 ROS升高在EPA诱导HepG-2细胞凋亡中的作用
• 3.4.2 ERK和JNK在EPA诱导HepG-2细胞凋亡途经中的作用
• 3.4.3 EPA通过线粒体途径诱导HepG-2细胞凋亡
• 3.4.4 Caspase家族成员在EPA诱导HepG-2细胞凋亡过程中的作用
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢