论文摘要
帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种以黑质多巴胺（dopamine,DA）能神经元变性坏死为主要病理特征的中枢神经系统退行性疾病,病因尚未阐明。足够的证据证实铁在帕金森病中是一个关键因素。但铁在黑质的选择性聚积的原因至今还不是十分清楚。新的铁转运蛋白的发现是铁代谢领域的重大突破,为解释这一问题提供了理论依据。二价金属离子转运蛋白1（divalent metal transport 1,DMT1）,也被称为具天然抗性的巨噬细胞蛋白2（nature resistance-associated macrophage protein 2,Nramp2）,是哺乳类的第一个跨膜铁转运蛋白。研究发现DMT1参与脑铁代谢,并且发现在PD病人脑黑质DMT1表达异常增高,这与PD病人脑内铁的异常沉积恰巧是同一个部位。本室前期研究亦表明在1-甲基4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP）制备的PD模型小鼠上,观察到黑质内铁选择性堆积和DMT1的表达增加,提示DMT1的高表达可能参与了铁聚积。本实验为了验证DMT1的表达增加可以导致铁聚积,选用MES23.5多巴胺能神经细胞系作为神经元的模型,应用分子生物学,免疫荧光,激光共聚焦显微镜,流式细胞仪,HPLC等方法研究了DMT1的高表达在细胞铁聚积中的作用。DMT1的高表达为PD的防治提供了新的药物作用靶点。人参皂苷Rg1是近年来研究较多的一种人参单体,药理研究表明它具有抗神经细胞凋亡、抗衰老、抗氧化、提高免疫力、类雌激素等作用。为探讨Rg1对6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OHDA）处理的MES23.5细胞铁代谢的影响,本实验应用荧光染料calcein结合激光共聚焦显微镜,逆转录聚合酶链式反应（reverse transcriptase polymerase chainreaction,RT-PCR）,Western blots等方法检测了Rg1对细胞内铁水平和DMT1表达的影响,并进一步研究其可能机制。结果发现:一.DMT1的高表达在MES23.5细胞铁聚积中的作用1.免疫荧光检测结果显示DMT1+IRE和DMT1-IRE在体外培养的MES23.5细胞上均有表达。2.应用RT-PCR的方法从人胚近段小肠中获取人的全长DMT1 cDNA,包括+IRE型和-IRE型,测序结果正确。利用细菌内同源重组法成功构建了携带DMT1编码基因的重组腺病毒载体。经PacI酶切鉴定和PCR鉴定获到重组腺病毒载体pAdEasy1-DMT1+IRE和pAdEasy1-DMT1-IRE。重组腺病毒质粒转染293细胞成功制备了高滴度的重组腺病毒。3.重组腺病毒AdDMT1+IRE或AdDMT1-IRE分别感染MES23.5多巴胺能神经细胞系,24 h后可观察到绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的表达。Western blots检测到AdDMT1+IRE感染的细胞DMT1+IRE的蛋白水平较病毒对照组有明显的增加;AdDMT1-IRE感染的细胞DMT1-IRE的蛋白水平较病毒对照组有明显升高（P＜0.01）。4.MTT测定结果显示AdDMT1+IRE或AdDMT1-IRE感染的MES23.5细胞在铁孵育（100μmol/L）24 h后,细胞存活率均明显降低,较对照组有统计学意义（P＜0.05）。5.细胞铁含量检测结果显示AdDMT1+IRE或AdDMT1-IRE感染的MES23.5细胞铁孵育（100μmol/L FeSO4）后细胞内铁含量均高于病毒对照组（P＜0.01）。而细胞内羟自由基和MDA含量较病毒对照组有明显的增加,差别有统计学意义（P＜0.01）。6.MES23.5细胞铁孵育后检测细胞凋亡包括caspase-3的活性,DNA ladder和Hoechst染色,结果显示AdDMT1+IRE或AdDMT1-IRE感染的MES23.5细胞铁孵育后caspase-3的活性明显增加（P＜0.01）,出现明显的凋亡梯度带和核固缩等凋亡的形态学变化（P＜0.05）。7.HPLC结果显示AdDMT1+IRE或AdDMT1-IRE感染的MES23.5细胞铁孵育后细胞内多巴胺含量均较病毒对照组有明显的降低（P＜0.05）。8.pcDNA3.1-DMT1+IRE和pcDNA3.1-DMT1-IRE表达载体构建成功,应用荧光染料calcein结合激光共聚焦显微镜技术检测了细胞的摄铁功能,结果表明pcDNA3.1-DMT1+IRE或pcDNA3.1-DMT1-IRE转染的MES23.5细胞摄铁功能较对照组明显增强（双因素方差分析,F=25.995,P＜0.01,pcDNA3.1-DMT1+IRE转染组vs.对照组;P＜0.01,pcDNA3.1-DMT1-IRE转染组vs.对照组）。9.pcDNA3.1-DMT1+IRE或pcDNA3.1-DMT1-IRE转染的MES23.5细胞铁孵育后可以引起铁介导的细胞氧化应激损伤,包括细胞内ROS含量的增加和线粒体膜电位的降低,差别有统计学意义（P＜0.05）。二.人参皂苷Rg1对6-OHDA处理的MES23.5细胞铁聚积的影响。1.10μmol/L 6-OHDA处理MES23.5细胞24 h后,细胞DMT1+IRE的蛋白表达水平明显高于对照组（P＜0.05）,而Rg1或vitamin E预处理均可以显著抑制6-OHDA诱导的DMT1+IRE的蛋白表达的上调（P＜0.05）。2.采用实时定量PCR的方法检测了不同处理组MES23.5细胞DMT1+IRE的mRNA表达变化,结果同蛋白表达变化,6-OHDA可以上调MES23.5细胞DMT1+IRE的mRNA表达水平（P＜0.05）,而Rg1或vitamin E预处理均可以抑制6-OHDA诱导DMT1+IRE的mRNA表达的上调（P＜0.05）。3.10μmol/L 6-OHDA处理MES23.5细胞24 h后细胞的摄铁功能明显增强,而Rg1或vitamin E预处理均可以抑制6-OHDA诱导细胞内铁水平的增加（双因素方差分析,F=18.102,P＜0.01,6-OHDA处理组vs.对照组;P＜0.01,Rg1或vitamin E预处理组vs.6-OHDA处理组）。4.本实验应用Western blots的方法分别检测了铁调节蛋白1（iron regulatory protein 1,IRP1）和铁调节蛋白2（iron regulatory protein 2,IRP2）的蛋白表达水平。结果显示6-OHDA可以同时增加细胞的IRP1和IRP2的蛋白表达水平（P＜0.05）。而Rg1或vitamin E预处理均可以抑制6-OHDA诱导的IRP1和IRP2的蛋白表达的上调（P＜0.05）。5.本实验应用RT-PCR的方法检测了细胞IRP1和IRP2的mRNA表达水平。结果显示10μmol/L 6-OHDA处理MES23.5细胞24 h后细胞的IRP1和IRP2的mRNA表达均明显上调（P＜0.05）。而Rg1或vitamin E预处理均可以抑制6-OHDA诱导的IRP1和IRP2的mRNA表达的上调（P＜0.05）。差别有统计学意义。6.10μmol/L 6-OHDA处理MES23.5细胞24 h后给予100μmol/L的铁孵育,细胞线粒体跨膜电位明显降低,而Rg1预处理均可以抑制6-OHDA介导的线粒体跨膜电位的降低。综上所述,铁转入蛋白DMT1+IRE和DMT1-IRE在体外培养的MES23.5多巴胺能神经细胞系中均有表达;DMT1的表达增加可能是导致细胞内铁聚积的主要原因之一,这种细胞内铁含量的升高可能是由于细胞的摄铁功能的增加所致。细胞内增加的铁可以通过Fenton反应产生羟自由基,损伤细胞脂质,线粒体,从而导致细胞内羟自由基,脂质过氧化产物丙二醛含量的增加,细胞线粒体膜电位的降低,最终激活caspase-3途径引起细胞的凋亡。而Rg1可以通过IRP/IRE途径来调节6-OHDA诱导的DMT1+IRE的表达上调,降低细胞内铁聚积从而减轻铁聚积对细胞的损伤。
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