利用cDNA-AFLP技术对大白菜杂交种白引2号杂种优势的研究

论文摘要

杂种优势是生物界普遍存在的十分重要的生物学现象,并在多种动植物中得到成功的利用。芸薹属（Brassica）作物是杂种优势利用最为普遍的一类作物。国内外学者在近一个世纪对杂种优势机理的研究中做了大量的理论和实验探讨,在方法和指导思想上取得了一些进展,提出了许多的学说。杂种优势产生的机理仍然是一个末解之谜,还有许多问题需要深入研究。本文以‘白引2号’杂交种及其亲本为材料应用cDNA-AFLP技术研究基因的差异表达,方法如下:分别在幼苗期、莲座期和结球期剪取嫩叶,提取叶子的总RNA,利用反转录酶将其反转录成cDNA后进行AFLP（amplified fragment length polymorphism）分析。cDNA-AFLP操作中选择EcoRⅠ和MseⅠ对双链cDNA进行限制性酶切,得到的粘性末端分别连接上人工接头,预扩增后再用64对选择性引物扩增并在6%聚丙烯酰胺凝胶电泳后用银染方法染色进行指纹图谱分析。本研究表明杂交种和亲本间存在显著的基因表达差异。杂交种和亲本间差异表达的条带可分为四种类型:（1）杂种特异表达的类型;（2）双亲共沉默类型;（3）单亲表达一致类型（偏母本和偏父本）;（4）单亲表达沉默类型（偏母本和偏父本）。本研究结果:在不同的发育时期找到了29条差异片段,其中5个幼苗期的差异片段,14个莲座期的差异片段,10个结球期的差异片段。19个在杂种中表达,3个在双亲中都表达,2个在双亲之一（母本）中表达,5个在双亲之一（父本）中表达。将29个差异片段的序列经同源性序列比对检索,13个可以在NCBI数据库中找到同源序列,16个没有在数据库中找到同源序列,推测可能是新基因。对13个已知序列的分析表明,这些片段参与了代谢、信号转导等过程。29个基因片段的蛋白质序列经同源性比对,结果发现两个基因片段分别含有AP2/EREBP结构域和PPR结构域。而这两个结构域在控制植物生长发育方面具有重要的作用。本文应用cDNA-AFLP技术研究大白菜基因的差异表达。本文研究的结果将为以后进一步揭示杂种优势的分子机理提供依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 植物杂种优势及其研究进展
• 1.1.1 杂种优势的特点
• 1.1.2 杂种优势类型的划分
• 1.1.3 植物杂种优势的研究进展
• 1.2 植物杂种优势遗传机理假说
• 1.2.1 显性假说
• 1.2.2 超显性假说
• 1.3 杂种优势遗传机理新理论
• 1.3.1 基因差异表达调控与杂种优势的关系
• 1.3.2 遗传距离与杂种优势的关系
• 1.3.3 QTL 效应和与杂种优势的关系
• 1.3.4 上位性效应与杂种优势的关系
• 1.3.5 酶与杂种优势的关系
• 1.4 遗传机理的新假说
• 1.4.1 遗传平衡假说
• 1.4.2 活性基因假说
• 1.4.3 遗传振动合成学说
• 1.4.4 基因网络系统及自组织理论
• 1.5 杂种优势的利用
• 1.5.1 两系法杂种优势利用
• 1.5.2 杂种优势的固定
• 1.5.3 创造不育系利用杂种优势
• 1.6 杂种优势的研究展望
• 1.7 CDNA–AFLP 技术的原理及其应用
• 1.7.1 cDNA–AFLP 技术综述
• 1.7.2 cDNA-AFLP 的技术原理
• 1.7.3 cDNA-AFLP 的技术特点
• 1.7.4 cDNA-AFLP 技术的应用
• 1.7.5 cDNA-AFLP 技术的发展
• 1.8 大白菜发育的分子生物学研究进展
• 1.8.1 大白菜的表达序列标签
• 1.8.2 大白菜发育的研究
• 2 材料与方法
• 2.1 材料和试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 总RNA 的提取和检测
• 2.2.2 合成双链cDNA
• 2.2.3 cDNA 的酶切
• 2.2.4 接头的连接
• 2.2.5 预扩增反应
• 2.2.6 预扩产物的选择性扩增
• 2.2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.8 银染
• 2.2.9 AFLP 多态性片段的回收、纯化
• 2.2.10 回收片段与pGEM-T Easy 克隆载体的连接
• 2.2.11 AFLP 多态性片段的克隆、测序
• 2.2.12 序列分析
• 3 结果与分析
• 3.1 RNA 的提取
• 3.2 双链CDNA 的合成
• 3.3 酶切对实验的影响
• 3.4 CDNA-AFLP 多态性分析
• 3.4.1 cDNA 酶切片段的预扩增
• 3.4.2 预扩增产物的选择性扩增
• 3.4.3 引物筛选及差异条带的获得
• 3.5 回收片段的重新扩增
• 3.6 重组质粒的筛选及鉴定
• 3.6.1 重组质粒的筛选
• 3.6.2 重组质粒的酶切鉴定
• 3.7 特异片段的测序与序列分析
• 4 讨论
• 4.1 CDNA-AFLP 分析不同时期杂交种及其亲本的基因表达变化
• 4.2 本研究所用的方法及技术特点
• 4.3 CDNA-AFLP 试验体系中应注意的问题
• 4.4 影响染色的关键因素
• 结论
• （一） 结论
• （二） 本实验的局限性
• （三） 后继工作
• 参考文献
• 附录
• 致谢