锰核土壤不同土层锰氧化细菌群落结构与多样性研究

论文摘要

锰氧化细菌[Mn（II）-oxidizing bacteria]是一类可将Mn（Ⅱ）氧化成Mn（Ⅲ）或Mn（Ⅳ）型高锰氧化矿物、且在系统发育上呈现较大多样性的细菌类群。其氧化形成的锰矿化物是环境中一种高活性的矿物成分,具有很强的氧化和吸附作用,可广泛地参与自然界中各种有机和无机化合物的氧化还原反应,并吸附多种重金属和微量元素,决定着环境中许多物质的形态、迁移和转化,从而在元素生物地球化学循环中起着重要的作用,因此其形成机制和环境效应备受关注。目前,国内外对锰氧化细菌与锰氧化作用的研究工作主要集中于海水、海底沉积物与淡水等水相环境,而对陆地土壤中的锰氧化细菌的研究很少。本研究以土壤锰氧化细菌为研究对象,对采集于国内一处含有丰富铁锰结核的棕壤微生态环境中的锰氧化细菌种群结构与多样性,分别采用培养法和非培养法系统性地进行了研究。从山东崅峪棕壤同一剖面层的表土层（surface soil layer, A层）、心土层（subsoil layer, B层）和底土层（substratum, C层）分别采集得到土壤样品,对其进行了化学组分测定分析,同时用普通的细菌培养基对其中的土壤细菌进行计数和分离。结果显示该土样pH值是微碱性的,且具有比较高含量的MnO2和Fe2O3。经划线分离,从各层土样PH共分离得到503株可培养细菌菌株,其中分属于A、B和C层分别为192、160和151株。对所有这些分离菌株用LBB指示剂法进行了锰氧化活性的测定,发现这些细菌中具有锰氧化活性的菌株占68.4%,显示出锰氧化细菌在该土壤环境中具有很丰富的分布属性,其中以A层的锰氧化分离细菌分布最丰富。不过,那些具有高锰氧化活性的细菌则主要分布于较深的B层和C层,分别占到了B、C层所有分离细菌的13.8%和13.2%。以高锰氧化活性细菌作为研究对象,经过16S rRNA基因的扩增、ARDRA （Amplified rDNA restriction analysis）、测序和序列比对后,发现50株高锰氧化细菌主要由24种细菌组成,分别属于厚壁菌门（Firmicutes）,放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）中的α-、β-、γ-分支,其中有7种新菌属是本研究首次发现具有锰氧化活性的。另外还发现厚壁菌类的高锰氧化细菌主要分布在A层,而又以芽胞杆菌（Bacillus sp.）为主。放线菌类高锰氧化细菌主要分布在B层和C层,在高锰氧化细菌中占的比例很大。变形杆菌类高锰氧化细菌在三层土壤的分布比例相差不大为监测不同浓度的锰对土壤细菌群落多样性的影响,在实验室条件下用含不同浓度的Mn（Ⅱ）的K培养基对不同土层的土壤进行富集,分别在第1 d、第3 d、第7 d和第10 d取样,并用变性梯度凝胶电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE）来直观反映土壤细菌群落随Mn（Ⅱ）浓度的高低以及富集时间的变化,并用DGGE图谱软件进行直观和精确分析,结果显示原始土壤的细菌群落多样性是随着土层的增加而降低的,而经过不同浓度的Mn（Ⅱ）富集后,细菌多样性在各层土壤中都得以显著增加,不过增加的程度有所不同；该土壤中的细菌表现出对Mn（Ⅱ）的耐受性,尤其是A层,其在10 mM Mn（Ⅱ）的浓度富集时,细菌群落平均多样性最高,而在B、C层分别是1 mM和0 mM。此外,对富集样品DGGE图谱中随机选择的37个优势条带的克隆测序表明,其所代表的锰富集细菌主要属于厚壁菌、变形菌门中的β-和γ-分支,从而表现出与土壤锰氧化细菌的种群结构与分布属性的一致性。以上研究结果表明,土壤环境中的锰氧化细菌种群结构与多样性表现出对锰氧化作用的高度适应性,并表现出和水相环境的锰氧化细菌系统进化的相似性,间接反映出这些细菌在土壤锰结核和锰矿化物形成过程中的具有重要作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 自然界中的锰氧化物
• 1.2 锰氧化物的生物成因
• 1.2.1 锰氧化细菌
• 1.2.2 锰氧化物的生物成因机制
• 1.3 土壤微生物群落结构和多样性研究方法
• 1.3.1 研究方法概述
• 1.3.2 荧光原位杂交（FISH）
• 1.3.3 核糖体DNA扩增片段限制性内切酶分析（ARDRA）
• 1.3.4 末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）
• 1.3.5 变性梯度凝胶电泳（DGGE）
• 1.3.6 16S rDNA克隆文库
• 1.3.7 单链构象多态性（SSCP）
• 1.4 土壤环境的锰氧化细菌研究进展
• 1.5 研究目的和意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 样品
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 PCR引物
• 2.1.5 分析软件
• 2.1.6 培养基
• 2.1.7 菌株和载体
• 2.2 方法
• 2.2.1 样品的采集和保存
• 2.2.2 土壤化学性质的测定
• 2.2.3 土壤可培养好氧细菌的计数和分离
• 2.2.4 分离细菌的锰氧化活性测定及鉴定
• 2.2.5 各层土壤的富集培养及取样
• 2.2.6 各层原始土壤及土壤富集液总DNA的提取
• 2.2.7 总DNA的PCR反应及产物纯化
• 2.2.8 变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析
• 2.2.9 用"压碎与浸泡法"回收DGGE的优势条带
• 2.2.10 扩增回收的DGGE条带
• 2.2.11 PCR产物的克隆
• 3. 结果与分析
• 3.1 不同土层的理化性质
• 3.2 各土层可培养好氧细菌种群总数测定及分离纯化
• 3.3 各土层分离细菌的锰氧化活性测定结果
• 3.4 高锰氧化活性菌株的鉴定
• 3.4.1 高锰氧化活性菌株16S rRNA基因的扩增
• 3.4.2 高锰氧化活性菌株的ARDRA分析
• 3.4.3 高锰氧化活性菌株系统进化树的建立
• 3.5 各土层的富集培养液的pH值测定
• 3.6 土壤及土壤富集液的总DNA抽提结果
• 3.7 土壤及土壤富集液的总DNA的PCR扩增结果
• 3.8 变性梯度凝胶电泳及图谱分析
• 3.8.1 变性梯度凝胶电泳（DGGE）
• 3.8.2 仙农指数（The Shannon index of bacterial diversity,H）分析
• 3.8.3 多维尺度（multidimensional scaling,MDS）分析
• 3.9 DNA片段的回收、克隆、测序
• 4. 讨论
• 4.1 锰氧化细菌的多样性
• 4.2 锰氧化细菌的组成
• 4.3 不同浓度的锰对土壤细菌群落多样性的影响
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间的论文情况
• 致谢