GAS41与转录因子AP-2β相互作用并增强AP-2β的转录活性

论文摘要

转录因子通过对细胞内外刺激作出反应调节基因的表达,它们常常通过控制基因转录的基本机制在决定细胞的命运中起主要的作用。转录因子AP-2就在许多参与哺乳动物发育、分化和癌症形成的基因转录调节中起到了重要的作用。最近很多研究表明与AP-2相互作用的蛋白能够调节AP-2对下游基因的转录活性。作为AP-2转录因子家族成员,AP-2β是一类细胞类型特异性蛋白质,参与了许多神经、上皮和尿生殖发育。人类Char综合症是指动脉导管异常。颅面部异常和小指缺陷。最近发现AP-2β基因的错义突变引起Char综合症。而且AP-2β的敲除鼠由于肾小管上皮过度凋亡引起肾脏出现囊肿而死亡。因此AP-2β在胚胎发育中起到了关键的作用。但是到目前为止还没有报道与AP-2β相互作用的蛋白质。为了寻找与之相作用的蛋白,我们使用AP-2β作为诱饵蛋白,采用酵母双杂交技术筛选HeLa cDNA文库,找到GAS41与AP-2β相互作用。然后在体内通过免疫共沉淀和荧光共定位证明它们确实存在相互作用,而且在体外进行GST的Pull-down分析也得到同样的结果,进一步确定两个蛋白相互作用的区域,GAS41与AP-2β的N端相互作用,而GAS41的C端与AP-2β相互作用。此外,发现GAS41通过与AP-2β相互作用后增强了AP-2β对AP-2反应元件报告基因的转录活性。最后,EMSA分析也显示GAS41与AP-2β相互作用后增强了AP-2β的DNA的结合活性。这表明GAS41一个新的细胞功能是作为AP-2β的转录辅助激活因子。

论文目录

• 前言
• 1 转录激活因子AP-2基因家族
• 2 神经胶质瘤扩增序列41（GAS41）的简介
• 第一部分 材料与方法
• 1 材料
• 2 实验方法
• 2.1 表达载体的构建
• 2.2 融合蛋白质的表达和抗体的制备
• 2.3 细胞培养
• 2.4 AP-2β与GAS41之间的相互作用分析
• 2.5 GAS41与AP-2β相互作用后对AP-2β的转录活性的影响
• 2.6 GAS41与AP-2β相互作用后对AP-2β的DNA结合活性的影响
• 第二部分 结果与分析
• 1 表达载体的构建
• 1.1 GAS41、GAS41N和GAS41C表达载体的构建
• 1.2 AP-2β、AP-2βN和AP-2βC表达载体的构建
• 2 蛋白质的表达和纯化及抗体的制备
• 2.1 GST-AP-2β、GST-AP-2βN、GST-AP-2βC及GST的表达与纯化
• 2.2 His-GAS41、His-GAS41N和His-GAS41C的表达与纯化
• 2.3 抗血清用Western-Blot检测
• 3 蛋白质相互作用的分析
• 3.1 免疫共沉淀分析（Co-IP）
• 3.2 细胞共定位分析（Co-localization）
• 3.3 Pull-down分析
• 4 GAS41与AP-2β相互作用后对AP-2β转录活性的影响
• 5 GAS41与AP-2β相互作用后对AP-2β结合活性的影响（EMSA）
• 5.1 DNA结合实验检测所表达AP-2β蛋白质的活性
• 5.2 表达蛋白质AP-2β与标记探针和非标记的探针的竞争性结合
• 5.3 GAS41与AP-2β相互作用后对AP-2β结合活性的影响
• 第三部分 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录1
• 附录2