P6蛋白在草莓镶脉病毒致病过程中的功能研究

论文摘要

植物病毒致病性的强弱往往与其基因组编码的症状决定因子密切相关，即症状决定因子能够协助该病毒成功侵染寄主，使寄主呈现发病症状甚至死亡。本研究克隆了草莓镶脉病毒（SVBV）中国分离物P6基因，以病毒载体携带P6基因或P6突变体基因接种本氏烟，并以双元表达载体携带P6基因转化本氏烟和普通烟，观察接种植株以及转基因植株症状表型，明确P6在病毒侵染和症状形成中的作用，以确定SVBV P6的症状决定子功能。本研究最终将在分子水平上明确SVBV的致病机制，对进一步研究寄主植物和病毒之间防御和反防御的分子机制以及控制病毒病危害均具有重大意义。1. SVBV P6基因的克隆及序列分析从感染SVBV的草莓叶片中提取总DNA，设计特异性引物扩增SVBV P6全长基因，克隆并测序。得到的SVBV中国分离物P6基因序列（SVBV-CH P6）全长1557bp，编码518个氨基酸（AA）。将其与SVBV美国分离物（SVBV-NC001725）以及花椰菜花叶病毒属其它成员的P6全长基因序列相比较，结果表明，SVBV中国分离物P6基因与SVBV美国分离物P6基因核苷酸序列相似性最高，达84.5%；而与花椰菜花叶病毒属其它成员的P6基因序列相似性均较低，仅为23.7%27.9%。构建SVBV及其同属其他成员P6基因的系统关系树，结果显示，SVBV中国分离物与SVBV美国分离物单独形成一个分支，说明来源于草莓的2个SVBV亲缘关系最近，而与其同属其它成员的亲缘关系均较远。生物信息学分析表明，SVBV P6基因表达的P6蛋白序列含有多种蛋白激酶磷酸化位点，其二级结构N端是一个α-螺旋富集区。2. SVBV P6基因及其系列缺失突变体植物表达载体的构建将SVBV2个分离物P6基因及其缺失突变体基因分别克隆到病毒载体pGR106上，获得阳性克隆pGR-CH P6，pGR-US P6，pGR-CH△P6和pGR-US△P6；将2个P6基因克隆到双元表达载体pCAM2300上，获得阳性克隆pCAM-CH P6，pCAM-US P6。3.表达载体以根癌土壤杆菌介导进行瞬间表达利用电击转化方法，将表达载体pGR-CH P6，pGR-CH△P6，pGR-US P6，pGR-US△P6表达载体和pGR106空载体导入根癌土壤杆菌，分别接种本氏烟叶片。15d后，观察本氏烟系统叶发病情况。pGR-CH P6，pGR-US P6表达载体接种的本氏烟系统叶呈现严重的花叶症状，顶部叶片皱缩，下卷；pGR-US△P6，pGR-CH△P6表达载体接种本氏烟后，其系统叶呈现轻花叶症状，顶部叶片基本可以展开，无明显下卷症状；接种pGR106空载体的系统叶只呈现PVX病毒典型的轻花叶症状，顶部叶片发育正常。4.瞬间表达烟草中P6基因的分子检测提取接种本氏烟的总RNA，RT-PCR检测PVX病毒片段和P6基因。结果发现，接种pGR-CH P6，pGR-CH△P6，pGR-US P6，pGR-US△P6的本氏烟系统叶中检测到P6基因片段和PVX病毒特异性片段。而接种空载体pGR106的本氏烟系统叶中则检测不到P6基因片段，只能检测到PVX病毒特异性片段。检测到P6基因的本氏烟进一步进行半定量RT-PCR检测，发现插入P6基因的表达载体和突变体表达载体接种的本氏烟，P6基因转录RNA水平无明显差异。5.瞬间表达烟草中P6蛋白对PVX复制量的影响pGR-CH P6、pGR-CH△P6和pGR106分别接种本氏烟，双抗体夹心ELISA法检测本氏烟系统叶中PVX的复制量。结果发现，接种pGR-CH P6的本氏烟系统叶中，PVX的复制量最高，较接种空载体pGR106的本氏烟中PVX的复制量提高了60.7%；接种pGR-CH△P6的本氏烟系统叶，PVX的复制量与对照相比差异不明显。6.转基因烟草的分子鉴定及症状观察将构建的表达载体pCAM-CH P6转入根癌土壤杆菌，叶盘法转化本氏烟和普通烟。提取转基因烟草的总DNA，利用特异性引物PCR检测转基因烟草，证明已将SVBV中国分离物的P6基因转入本氏烟和普通烟。症状观察发现，转基因的本氏烟出现顶部叶片上卷症状；转基因普通烟与野生型普通烟相比较，并没有呈现明显发病症状。7.瞬间表达及转基因烟草中P6蛋白的检测Western Blot检测发现，pGR-CH P6注射接种的本氏烟系统叶中有高丰度的P6蛋白积累。而pGR-CH△P6接种的本氏烟中，P6蛋白累积量显著降低。空载体pGR106接种的本氏烟中则检测不到P6蛋白。转基因本氏烟叶片中可以检测到P6蛋白，但其积累量非常低。转基因本氏烟P6蛋白的表达丰度甚至低于pGR-CH△P6接种的本氏烟，而非转基因本氏烟检测不到P6蛋白的积累。

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Abstract

文献综述

1 草莓镶脉病毒的研究概况

1.1 草莓镶脉病毒的分布与危害

1.2 草莓镶脉病毒侵染寄主后的症状

1.3 草莓镶脉病毒的寄主及传播途径

1.4 草莓镶脉病毒的基因组结构、功能及变异

2 病毒与植物寄主的互作

2.1 植物寄主对病毒的防御反应

2.2 病毒对寄主植物防御反应的应答

3 病毒的致病性相关因子

引言

材料与方法

1 供试材料

1.1 病样来源

1.2 植物材料

1.3 菌种和载体

1.4 酶和化学试剂

1.5 常用缓冲溶液和培养基

1.6 抗生素

1.7 仪器设备

2 试验方法

2.1 叶片总 DNA 的提取

2.2 叶片总 RNA 的提取

2.2.1 提 RNA 的准备工作

2.2.2 Trizol 抽提液提取总 RNA 方法

2.3 cDNA 的合成

2.4 PCR 技术

2.5 PCR 产物的克隆

2.5.1 PCR 产物回收和纯化

2.5.2 PCR 产物的连接

2.5.3 感受态细胞的制备

2.5.3.1 Ecoli DH5 α感受态细胞的少量制备（CaCl2法）

2.5.3.2 农杆菌感受态细胞的少量制备

2.5.4 连接产物的转化

2.5.4.1 连接产物转化大肠杆菌

2.5.4.2 连接产物转化农杆菌（冻融法）

2.5.5 阳性克隆的 PCR 鉴定

2.5.6 质粒提取

2.6 重组质粒的鉴定

2.7 克隆基因的测序、分析和登录

2.8 SVBV P6 基因的克隆及序列分析

2.8.1 扩增 SVBV 中国分离物 P6 基因的引物设计

2.8.2 扩增 SVBV 美国分离物 P6 基因的引物设计

2.8.3 SVBV 中国分离物 P6 基因的 PCR 扩增

2.8.4 SVBV 美国分离物 P6 基因的 PCR 扩增

2.8.5 SVBV P6 基因序列相似性分析

2.8.6 SVBV P6 基因序列结构分析

2.9 植物表达载体的构建策略

2.9.1 瞬间表达 SVBV P6 基因及其缺失突变体植物表达载体的构建策略

2.9.2 转基因 SVBV P6 基因植物表达载体的构建策略

2.10 植物表达载体的构建过程

2.10.1 扩增 SVBV P6 基因的引物设计与合成

2.10.2 扩增 SVBV P6 基因缺失突变体引物设计与合成

2.10.3 SVBV P6 基因及其缺失突变体基因的克隆

2.10.4 SVBV P6 基因及其缺失突变体基因植物表达载体的构建

2.10.5 重组植物表达载体导入农杆菌

2.11 瞬间表达接种本氏烟

2.12 瞬间表达烟草的 RT-PCR 检测

2.13 半定量 RT-PCR

2.14 植物可溶性蛋白样品的制备

2.15 SDS-PAGE

2.16 Western Blot 分析

2.17 植物病毒的 ELISA 检测

2.18 烟草转化及卡那霉素抗性植株的获得

2.19 转基因烟草阳性植株的检测

结果与分析

1 SVBV P6 基因的克隆及序列分析

1.1 SVBV 中国分离物 P6 基因的 PCR 扩增

1.2 SVBV 美国分离物 P6 基因的 PCR 扩增

1.3 SVBV P6 基因阳性克隆的筛选

1.4 SVBV P6 基因的序列分析

2 SVBV P6 基因植物表达载体的构建

2.1 瞬间表达植物表达载体的构建

2.1.1 SVBV P6 基因阳性克隆的获得

2.1.2 pGR-CH P6 和 pGR-US P6 植物表达载体的构建

2.1.3 SVBV P6 突变体基因（△P6）的克隆

2.1.4 pGR-△CH P6 和 pGR-△US P6 植物表达载体的构建

2.2 转基因植物表达载体的构建

2.2.1 SVBV 中国分离物 P6 基因的克隆

2.2.2 pCAM-CH P6 植物表达载体的构建

2.2.3 SVBV 美国分离物 P6 基因的克隆

2.2.4 pCAM-US P6 植物表达载体的构建

3 瞬间表达本氏烟的症状表型及相关检测

3.1 瞬间表达本氏烟的症状表型

3.2 瞬间表达 PVX 病毒载体片段的 RT-PCR 检测

3.3 瞬间表达 P6 基因的 RT-PCR 检测

3.4 瞬间表达本氏烟 P6 基因半定量 RT-PCR 检测

3.5 瞬间表达本氏烟中 PVX 复制量的 ELISA 检测

4 转基因烟草阳性植株的获得、分子检测及症状表型

4.1 转基因烟草的获得

4.2 转基因烟草植株的分子检测

4.3 转基因阳性植株的症状表型

5 瞬间表达及转基因本氏烟中 P6 蛋白的 Western Blot 检测

讨论

1 SVBV P6 基因序列的克隆与序列分析

2 SVBV 中、美分离物的 P6 基因表达载体及突变体表达载体接种本氏烟

3 P6 基因转化烟草的症状表型

结论

参考文献

附录A：常用缓冲液及培养基配方法

附录B：常用的抗生素和激素及使用浓度

附录C：常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器

附录D：本文所用的重要缩写词及中文对照

致谢

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