论文摘要
目的⑴构建针对大鼠T淋巴细胞4-1BB基因编码区的小发夹RNA（shRNA）表达质粒和慢病毒载体系统,观察RNA（RNAi）对大鼠T淋巴细胞共刺激分子4-1BB基因表达和功能的影响。⑵探讨阻断T淋巴细胞4-1BB/4-1BBL共刺激通路在大鼠肝移植急性排斥反应中的作用。方法⑴根据RNAi作用原理,设计、合成4条T淋巴细胞4-1BB基因的shRNA（shRNA441、shRNA540、shRNA621、shRNA758）,插入质粒pGPU6,构建4个编码目的shRNA的表达质粒（p441、p540、p621、p758）,酶切及测序鉴定。设对照组,利用电穿孔法在体外将目的基因片段导入BN大鼠T淋巴细胞,48小时后,半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和流式细胞术（FCM）检测其对T细胞4-1BB基因表达的抑制作用,并筛选、确定最佳效果的干扰质粒。⑵利用筛选出的质粒,PCR扩增其中的U6+shRNA序列,克隆至慢病毒转移质粒pcDNA-CMV-Lentivector并经酶切和测序鉴定,与包装质粒以脂质体介导共转染293T细胞,产生shRNA重组慢病毒。病毒颗粒感染BN大鼠T淋巴细胞6～8 h后,与经丝裂霉素处理的Lewis大鼠淋巴细胞作单项混合淋巴细胞反应,设对照组和干扰组。RT-PCR、FCM、Western bloting方法检测4-1BB表达,MTT、3H-TdR检测干扰后T细胞的增殖能力,FCM测定凋亡细胞数,ELISA法检测细胞因子IL-2、IL-10、IFN-γ水平。⑶“二袖套法”行Lewis鼠到Brown Norway（BN）鼠原位肝移植24例,大鼠随机分成实验对照组、阴性对照组和干涉实验组,每组8对。三组的受体鼠分别在移植前12 h经阴茎背静脉注射1 ml生理盐水、空病毒和重组病毒液。于术后第5天每组处死BN鼠3只,取脾脏,RT-PCR、FCM检测在体T细胞4-1BB表达;取下腔静脉血检测细胞因子和生化指标;取肝组织观察病理变化;剩余大鼠观察术后生存情况。结果⑴经酶切反应及测序证实构建成功重组干扰质粒p441、p540、p621和p758,转染T细胞后,4-1BB相对表达量分别为（33.4±2.3）%、（53.0±2.3）%、（62.1±3.1）%、（40.9±1.5）%,对照组4-1BB相对表达量为（67.2±1.5）%。其中p441沉默效果最佳（p<0.01）。⑵经酶切反应及测序证实,重组慢病毒转移质粒pLVs441序列正确,包装产生病毒液（LVs441）滴度在5×106 TU/ml,浓缩后约3×108 TU/ml。LVs441感染T细胞效率约90%,干涉组4-1BB表达量显著下降（p<0.01）;T细胞凋亡较明显（p<0.05）;T细胞增殖能力、IL-2,IFN-γ水平低于实验对照组。⑶干涉组BN鼠脾淋巴细胞4-1BB表达量低于对照组（p<0.05）;两组IL-10、T-BIL水平无明显差别,但干涉组IL-2、IFN-γ和ALT、AST、LDH水平均低于对照组（p<0.05）;对照组和干涉组大鼠肝组织急性排斥Banff评分分别为7.11±0.78、5.89±1.05（p=0.0384）、平均生存时间分别为10.4±1.95天和29±14.78天（p<0.05）。结论⑴siRNA可特异性抑制大鼠T淋巴细胞共刺激分子4-1BB基因转录和表达,诱发T细胞凋亡,抑制大鼠T细胞的增殖能力,降低IL-2,IFN-γ等细胞因子的分泌水平。⑵RNAi阻断T细胞4-1BB/4-1BBL共刺激通路,可抑制肝移植大鼠急性排斥反应,延长受体存活时间。⑶电穿孔技术是质粒载体转染原代T淋巴细胞的一种有效方法。⑷慢病毒载体系统是携带siRNA进入T细胞的理想载体。