论文摘要
柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus, CTV）在世界各柑橘产区均有分布,且存在株系分化,主要有茎陷点株系、速衰株系及苗黄株系,其中速衰株系在以酸橙为砧木的柑橘上可引起树体的衰退,茎陷点株系引起葡萄柚和某些甜橙品种的茎陷点症状,病株果实变小、产量与品质降低,因此对柑橘产业造成严重的威胁。CTV是长线形病毒科（Closteroviridae）长线形病毒属（Closterovirus）成员,其基因组为全长约19.3 kb的+ssRNA,为已知基因组最大的植物病毒。目前全世界已报道有15个CTV分离物的全基因组序列,根据各分离物的基因组序列特点,可划分为5种基因型,即T30、VT、T36、T3和B165。为更深入了解我国发生的CTV的群体结构及分子特点,本研究选取了具有高度变异的CTV分离物S45为主要研究对象,对其分子变异特性进行了研究,同时分析了蚜虫传播对分离物Z5的分子变种组成的影响,结果如下。1.根据已报道的CTV基因组结构及序列设计引物,采用RT-PCR技术对CTV分离物S45的全基因组分片段进行扩增,对各扩增产物进行了克隆,选取各扩增片段的克隆9-16个,采用PCR-SSCP方法进行分析的结果显示,该CTV分离物是由多个分子变种组成的群体,各扩增片段均含有多种SSCP单体型,其单体型组成从2-6种不等。选取表现出不同SSCP带型的克隆进行测序,序列比对的结果显示,所扩增的各区域均存在一定分子变异,其中M2区域变异最大,克隆间的遗传距离为0.255±0.019。变异相对较小的是P27区域,克隆间的遗传距离为0.033±0.007,而CP基因的变异很小,所测序的6个克隆间仅有2-4个碱基差异,遗传距离为0.003±0.002。各克隆片段的序列与已报道的CTV分离物的序列比对分析的结果显示,该分离物基因组的部分区域同时存在与弱毒株系T30及强毒株系NZRB-G90且有较高序列相似性的分子变种,部分克隆则与二者的序列相似性均相对较低,推测可能存在两个株系间的重组。2.将相邻片段所测得的多个分子变种序列进行拼接,获得一个全长为19243 nt的基因组序列（命名为S45-R）。核苷酸序列比对结果表明,S45-R与GenBank上已登录的15个分离物的基因组全长序列相似性为80.0%-93.5%,与弱毒株系T30核苷酸序列相似性最高,为93.5%；但其CP基因与强毒株系NZRB-G90相似性最高,为97.2%,与T30为93.30%；P23蛋白在强弱毒株系鉴定的氨基酸位点则显示出与弱毒株系一致的特点,该结果进一步表明CTV分离物S45基因组内存在重组现象。采用RDP重组分析软件包对S45-R进行重组分析,发现所获全长序列内存在8个潜在的重组区域,各重组区域均被3种或3种以上方法检测到。其中RDP软件包的7种分析方法均从位于11483-13744 nt区域（位于P33、P6和P65 3个基因内）检测到重组事件,且均为极显著（P值从1.216×10-148到8.315×10-27）,其主要亲本和次要亲本分别为弱毒株系T30和强毒株系NZRB-G90。3.采用RT-PCR方法对本研究室保存的7个CTV分离物的CP基因进行扩增,选取扩增产物的阳性克隆进行PCR-SSCP分析,结果显示分离物N4、N9和N25的扩增产物表现为单一的SSCP单体型,N3、N21、Z30的扩增产物表现为3种单体型组成的混合群体,Z5的扩增产物表现为7种单体型组成的混合群体,即分离物内存在多个分子变种的混合侵染。选取种群结构最为复杂的分离物Z5为毒源,采用棉蚜对20株甜橙实生苗进行传毒,约3个月后进行病毒检测的结果显示,1株甜橙实生苗感染该病毒分离物,SSCP分析结果表明蚜虫传播对该分离物的分子变种具有一定的选择性,所分析的13个克隆均表现出与Z5毒源中优势分子变种一致的SSCP带型。