论文摘要
球毛壳菌（Chaetomium globosum）ND35菌株是一株从健康毛白杨（Populus tomentosa）分离出的内生真菌。表现出对多种病原真菌的拮抗活性,其次生代谢物质对多种农作物有较好的促生作用,并且能增强其抗病性。为了解球毛壳ND35菌株在接种植物后的侵染定殖方式和对植物生长的影响以及探索对球毛壳ND35菌株快速、准确的检测方法。本文主要进行了球毛壳ND35菌株在宿主植物杨树上的侵染定殖观察、球毛壳ND35菌株的RAPD特异序列标记转换、ND35对不同植物生长的影响、大田作物接种ND35后的组织分离检测及分子检测、实时荧光定量PCR技术检测球毛壳ND35菌株初探五个方面的研究,取得如下结果:本研究借助光学显微镜和荧光显微镜,结合免疫荧光标记技术,初步研究了球毛壳ND35菌株的菌丝在植物根组织表面侵入的行为和方式,同时借助光镜和透射电镜研究了ND35菌丝在杨树组培苗根内的定殖过程。结果表明:球毛壳ND35菌丝接种24 h后,菌丝从根表皮细胞之间的缝隙侵入根组织;接种48 h后,菌丝定殖于外皮层的细胞间隙;接种72 h后,许多菌丝定殖于杨树根的表皮细胞中。菌丝末端在侵染点形成了附着胞。一般大部分菌丝定殖于宿主植物根的表皮细胞和少量的外皮层细胞中,没有进入内皮层细胞和维管束组织。这为深入研究生防菌和病原菌与寄主植物的互作关系奠定了基础。本文首次报道了生防菌球毛壳ND35菌株的SCAR分子标记。本研究在建立RAPD优化体系的基础上,利用随机引物对毛壳菌属14个菌株和6个土传植物病原菌株进行分析,筛选到球毛壳ND35特异性RAPD条带,并根据测序结果设计特异PCR引物,得到引物对Cg ND35-F:5’-GTTGCCAGCCCGAGGGGAAG-3’,Cg ND35-R:5’-GTTACCAGC CATGC CTTGAAG-3’,首次获得了有实用价值的特异SCAR检测标记。通过回检验证其特异性,灵敏性,均得到理想结果。此方法快速、灵敏、准确。本研究中扩增出的球毛壳ND35菌株特异DNA片段及设计的一对特异引物均含有随机引物序列,保证了SCAR标记的准确性,从而实现球毛壳ND35的快速、准确分子检测,这为应用于田间检测球毛壳ND35菌株的定殖打下了基础。本研究继续利用常规的PCR及所设计的特异引物进行球毛壳ND35菌株定殖的田间检测,为内生真菌检测与鉴定提供了快速、准确、简便的方法。针对不同的供试材料经过试验摸索,采用效果好、效率高、成本低的CTAB法,获得了较理想的基因组DNA,为后续试验打下了良好的基础。通过前期SCAR标记试验设计的球毛壳ND35菌株特异引物进行检测,表明其能够成功地检测球毛壳ND35菌株在杨树、姜、小麦、马铃薯等植物体内的定殖。对于试验中的四种被测植物,进行了从接种球毛壳ND35菌株到采集后各植物组织生长量的变化和组织分离检测。结果表明,ND35菌株在被测植物的各组织内均能定殖,定殖量有所差异;处理组较对照组各生长量增长明显,显示了球毛壳ND35菌株对被测植物的促生作用。本研究利用SCAR标记获得的球毛壳ND35菌株特异片段设计了一对用于实时荧光定量PCR试验的引物,以球毛壳ND35菌株基因组DNA为模板,利用此对引物对实时荧光定量PCR反应的最佳体系,反应程序等进行了初步探索,得到了较为理想的结果,为以后开展利用实时荧光定量PCR技术的荧光检测系统对扩增过程进行实时监控,精确地检测出内生真菌的含量情况,动态变化等奠定了基础。