论文摘要
前言近年研究证实,体外循环（Cardiopulmonary bypass,CPB）病人的肠道是导致毒血症、脓血症、全身炎性反应综合征（SIRS）和多系统器官功能衰竭（MODS）的重要器官。它既是损伤的“靶”器官,又是损伤的始动因素。及早实施肠道（特别是肠粘膜）结构和功能的保护,是防止术后并发症的关键措施。紧密连接（Tight junction,TJ）是肠上皮细胞间的主要连接方式,在维持上皮细胞极性及调节肠屏障的通透性中发挥重要作用。CPB损害肠粘膜屏障的机制尚不完全清楚,CPB是否通过影响肠上皮紧密连接蛋白的表达而破坏肠粘膜的完整性,增加肠粘膜通透性并造成细菌易位和内毒素血症,迄今国内外未见文献报道。既往研究主要采用抑制炎症反应和提高肠道灌注及氧供等措施,对CPB期间肠道屏障功能加以保护,但均未达到理想效果。因此,从源头上采取相应的治疗措施,减少肠道内潜在致病菌和内毒素,维持肠道菌群平衡及增强肠道的物理屏障和免疫功能,从而减少CPB后细菌易位和炎症反应,对于降低并发症,改善临床治疗效果将具有重要意义。业已证实,生态疗法可重建胃肠微生态平衡,维持胃肠粘膜屏障,从而可减少菌群易位和内毒素血症。所谓生态疗法,通常包括选择性清洁肠道措施（selectivedeconta-mination of digestive tract,SDD）与微生态制剂的应用。Bengmark指出,生态免疫营养是21世纪的一大挑战,亦是目前临床研究的热点。鉴于CPB应激反应的特殊性以及SDD和微生态制剂的上述作用,本研究除从细胞、分子和基因水平上探讨CPB对肠屏障功能损伤的机制外,还将进一步探讨生态疗法用于CPB后肠屏障保护的可行性。旨在为其临床应用提供实验依据,亦为临床减少CPB手术后胃肠道并发症提供有效的防治措施。实验材料与方法一、实验材料1、实验动物:健康雄性SD大鼠,体重350～450g。2、主要试剂及药品:二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸标准品（Sigma公司,美国）,TNF-α、IL-6、IL-10免疫组化试剂盒（天津九鼎医学生物工程有限公司）,水合氯醛（上海化学试剂采购供应站分装厂）;抗occludin、ZO-1抗体（zymed公司,美国）,)金双岐（丽珠医药集团）,SIgA双抗夹心放免法试剂盒（邦定公司提供）,妥布霉素（常州兰陵制药有限公司）,20%乳果糖（云南通用善美制药有限责任公司）,大蒜素（厦门鱼肝油厂）。3、主要仪器:高速离心机（TDL—SA）;三用电热恒温水浴箱（DH）’—600);多功能振荡器;倒置显微镜（OLYMPUS—Ix70 Model,Japan）;RX-2000型全自动生化分析仪（美国Technicon公司）;TKR-200C小动物呼吸机（江苏特力麻醉呼吸设备公司）;特制微型膜肺（广东科威医疗器械有限公司提供采）;小型蠕动泵（保定兰格恒流泵有限公司,BT002300M型）。二、实验方法1、大鼠CPB的建立取雄性SD大鼠,以10%水合氯醛350 mg·kg-1腹腔内注射麻醉,气管插管接小动物呼吸机辅助呼吸。通过微型化CPB环路设备,经右颈静脉腔房引流、左颈动脉灌注方法建立大鼠CPB模型。2、实验分组SD大鼠48只随机分为SH、CPB、Y和SDD四组,CPB组24只,其余每组8只。SH组:为假手术对照组（Sham-operated group,SH）,大鼠只在相应部位插管,但不进行CPB转流。CPB组:分设CPB60min结束时和停CPB后2、4h时三个相点。Y组:为益生菌组,在实验开始前7天,每日用金双岐（由双歧杆菌、乳酸杆菌和嗜热链球菌组成的三联活菌制剂,含活菌数1亿/g）悬液2ml灌胃。SDD组:为选择性消化道去污组,在实验开始前3天,每日用三联抗生素悬液2ml（妥布霉素100 mg+20%乳果糖5m1/kg+大蒜素10mg/kg）灌胃。3、观察指标和检测方法（1）围CPB期血液动力学变化;（2）血浆DAO活性、D-乳酸、LPS浓度的变化（化学法）;（3）血浆IL-6、IL-10、TNF-α和sIgA的变化（放免法）;（4）远隔脏器的细菌易位,肠上皮组织病理检查（光镜）;肠粘膜超微结构的检查（电镜）;（5）肠粘膜Octludin和ZO-1蛋白表达（免疫组织化学法和Western blot法）。实验结果一、各组大鼠肠屏障功能的变化1、血浆DAO活性和D-乳酸浓度变化CPB组各时相点血浆DAO活性和D-乳酸浓度均明显升高,与SH组比较差异有统计学意义（P＜0.05）,且以CPB后2h时最高（P＜0.05）。而SH组的DAO活性和D-乳酸浓度无明显变化（P＞0.05）。Y组和SDD组血浆中DAO活性和D-乳酸浓度与CPB组相比明显减少,差异有统计学意义（P＜0.05）,与SH组相比仍有所升高,差异有统计学意义（P＜0.05）。2、血浆LPS浓度变化和远隔脏器的细菌易位CPB组静脉血浆LPS浓度和远隔脏器的细菌易位率逐渐升高,且在停CPB后4h达高峰,而SH组无明显变化,其差异有统计学意义（P＜0.05）。Y组和SDD组血浆中LPS乳酸浓度和远隔脏器的细菌易位率,与CPB组相比明显减少（但仍高于SH组）,其差异有统计学意义（P＜0.05）。二、各组大鼠血浆和小肠组织sIgA浓度的变化CPB组和SDD组血浆和小肠组织sIgA浓度明显降低,与SH组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。Y组血浆和小肠组织sIgA浓度均升高,与CPB和SDD组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。但仍低于SH组,其差异有统计学意义（P＜0.05）。三、血浆丁NF-a、IL-6和IL-10水平变化Y组、SDD组和CPB组血浆TNF-a、IL-6浓度明显升高,IL-10浓度明显降低,与SH组相比较,差异具有统计学意义（P＜0.05）;Y组和SDD组血浆TNF-a和IL-6浓度明显下降,IL-10浓度明显升高,与CPB组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。CPB组中血浆TNF-a、IL-6水平在CPB60min达高峰（P＜0.05）,之后略有下降,停CPB后4h时再次升高;血浆IL-10水平在CPB60min最低,之后略有回升,停CPB后4h再次降低（P＜0.05）。四、各组大鼠肠粘膜形态学改变1、HE染色光镜观察SH组大鼠除肠粘膜下层可见少量淋巴细胞浸润外,未见明显形态学改变。CPB组大鼠肠粘膜层变薄,部分绒毛萎缩,绒毛顶部上皮细胞变性、坏死、脱落,固有层出血、水肿,中央乳糜管扩大,淋巴细胞及中性粒细胞浸润,停CPB后2h时点改变最显著。Y组和SDD组小肠粘膜及粘膜下层毛细血管充血减轻,未发现明显的粘膜上皮脱落。2、透射电镜观察SH组大鼠肠上皮细胞微绒毛排列整齐,细胞连接结构正常,细胞器基本正常。CPB组小肠上皮微绒毛脱失,线粒体内质网空泡变性,紧密连接不清,且在停CPB后2h时点改变最为显著。Y组和SDD组小肠上皮有轻微微绒毛脱失,线粒体内质网空泡变性,但紧密连接较明显。五、各组大鼠肠上皮中occludin和Z0-1蛋白表达的变化1、免疫组化结果SH组中可见occludin和Z0-1蛋白均匀一致地分布于小肠上皮顶端细胞的边缘,呈蜂窝状或线状。而CPB组的occludin和Z0-1蛋白分布不均,染色变淡,以停CPB后2h改变最为显著。而Y组和SDD组的改变明显减轻。2、Western blot结果SH组occludin p65和Z0-1p220呈现高密度带;CPB组两条带明显减弱,活性降低,积分光密度值明显减少（P＜0.05）,以停CPB后2h改变最为显著。与CPB组比较,Y组和SDD组occludin和Z0-1蛋白表达明显增强,其差异有统计学意义,但仍低于SH组（P＜0.05）。六、肠上皮紧密连接蛋白表达变化与肠屏障功能的关系为探讨CPB后肠上皮紧密连接蛋白表达的变化与肠粘膜功能的关系,将CPB后肠上皮细胞occludin和Z0-1蛋白的表达和血浆DAO和活性和D-乳酸浓度进行相关分析。结果显示,紧密连接蛋白表达与血浆DAO和活性和D-乳酸浓度呈负相关（r2=0.8063,0.7312;r2=0.8228,0.8248,P＜0.05）。七、肠上皮紧密连接蛋白表达变化与炎症介质的关系为探讨CPB对肠上皮紧密连接蛋白表达的影响机制,将CPB后肠上皮细胞occludin和Z0-1蛋白的表达及血浆DAO活性、D-乳酸浓度和血浆TNF-a和IL-6水平变化进行相关分析。结果显示,紧密连接蛋白表达与血浆TNF-a、IL-6水平呈负相关（r2=0.678,0.6117;r2=0.5530,0.5309,P＜0.05）。血浆DAO活性和D-乳酸浓度和血浆TNF-a、IL-6水平正相关（r2=0.5565,0.6934;r2=0.7073,0.5549,P＜0.05）。结论1、CPB后肠粘膜上皮紧密连接蛋白表达的下调可能是CPB所致肠粘膜屏障功能损伤的机制之一。2、益生菌预处理可抑制CPB后炎症反应,降低肠道细菌易位率;增加小肠上皮occludin和Z0-1及小肠组织sIgA水平,从而改善CPB后大鼠肠屏障功能。3、选择性消化道去污可抑制致病菌生长,减轻CPB后内毒素血症及上调肠上皮紧密连接蛋白的表达,从而对CPB后肠屏障功能有一定的保护作用。4、益生菌疗法维持肠道菌群平衡及免疫功能作用强,副作用小,且经济安全。
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