论文摘要
TA4基因是柔嫩艾美耳球虫（E．tenella）孢子化卵囊的一个表面抗原基因，其表达的蛋白具有一定的免疫原性；EtMIC4是编码E．tenella细胞器微线蛋白的基因，在子孢子及裂殖子阶段表达，分泌的蛋白向后覆盖于虫体的表面，与宿主细胞表面相黏附，参与虫体的运动及入侵。本文以TA4基因和与球虫入侵宿主细胞有关的EtMIC4部分基因作为研究目标，根据Genbank中登录的序列设计引物，利用RT-PCR技术从E．tenella（上海株）孢子化卵囊中扩增出TA4基因和EtMIC4基因的一部分。经琼脂糖凝胶电泳检测，将大小与TA4基因预计分子量一致的片段纯化后连接到pGEM-T-easy克隆载体中，再转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，得到的转化子经PCR鉴定和酶切分析筛选阳性克隆；将大小与EtMIC4基因片段预计分子量一致的片段纯化并经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切回收后，与经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切回收的pET-28-a和pET-32-a表达载体连接。结果表明：①得到了含有TA4基因的阳性重组子（pGEM-TA4），经核苷酸测序，该序列全长773bp，其中TA4基因的阅读框为651bp，编码216个氨基酸，与国外报道的TA4基因（登录号：M21004.1）比较，序列的同源性为100％（773／773）。与国内报道的TA4（浙江株）基因（登录号：DQ327836.1）比较，序列的同源性为99％（765／770），即在TA4（浙江株）基因序列的38bp、51bp、229bp、462bp和635bp处的碱基分别是G、A、G、T、T而TA4（上海株）的则是A、C、A、A、C，其中51bp和229bp处碱基不同，其翻译后相应的氨基酸也不同，在浙江株是Met和Arg，而在上海株则是Leu和Lys，其它氨基酸相同：②得到了含有EtMIC4基因片段的阳性重组子（pET-28-a-EtMIC4和pET-32-a-EtMIC4），经核苷酸测序，该基因序列全长1351bp，其中基因的阅读框为948bp，编码315个氨基酸，该序列与Tomley等发表的序列（登录号：AJ306453.1）进行网上比对后发现：两者之间有99％（1138／1140）的同源性，即在EIMIC4（登录号：AJ306453.1）序列的6061bp和6126bp处的碱基分别为T和G，而在EtMIC4（上海株）则是C和A；此外在EtMIC4（登录号：AJ306453.1）序列的5510bp处比其多125个碱基，但多的碱基位于基因的阅读框之外；与杜爱芳等发表的5401基因序列（登录号：AY819649.1）有99％（861／864）同源性；推测这种碱基不同的现象，可能是由于E．tenella不同地理株之间存在一定的遗传差异所导致的。将经测序为正确的重组克隆质粒（pGEM-TA4）用EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切并回收后，与经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切回收的pET-28-c相连接；用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切并回收后，与经EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切回收的pGEX-4T-2相连接，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，得到的转化子经PCR鉴定和酶切分析，筛选出符合正确阅读框的重组子，构建成重组表达质粒（pET-28-c-TA4和pGEX-4T-2-TA4）。