鸡贮精腺差异表达基因的研究

论文摘要

禽类品种间和个体间的性状差异本质上都是由于基因种类的差异和基因表达量的差异所致。对同一个体不同组织或不同个体相同组织的基因表达差异进行比较研究,可获得与生命过程相关的信息,揭示不同性状的发生发展机理。禽类输卵管的子宫阴道交接部存在一种特殊的管状腺,该腺体由单层柱状上皮细胞构成,腺管细胞顶部无纤毛,细胞核排列整齐,位于细胞的基部,因精子在此贮存而被称为贮精腺。贮精腺的存在使禽类精子在输卵管内可以长期存活,并能长时间保持受精能力。自贮精腺被发现以来,人们从贮精腺的组织学和生殖生理学等方面进行了广泛的研究,但这些研究还不足以解释贮精腺的贮精机理。本实验利用mRNA差异显示技术,以29bp的10条锚定引物和25bp的10条随机引物进行DDRT-PCR分析不同处理及不同持续受精能力的母鸡的贮精腺组织。通过对100个引物组合的筛选后发现有63对引物组合的扩增效果较好,其中有差异条带的引物组合有23对,共获得差异条带30条,二次扩增重复出现的差异条带有13条,通过克隆、测序及序列分析,获得6个ESTs序列。对获得的6个ESTs序列进行基因信息学分析发现:SST01部分序列与鸡第2号染色体上的Neurexophilin基因的一部分相似,其同源性达97.8%,推测SST01与贮精腺生理功能的神经调控有关;SST02部分序列与鸡第3号染色体上的丝裂素活化蛋白激酶基因的一部分相似,其同源性达98.7%,推测SST02与贮精腺上皮细胞的增殖、分化有关;SST03部分序列与鸡第8号染色体上磷脂酰肌醇蛋白聚糖基因的一部分相似,其同源性达98.5%,推测SST03与细胞的生长分化有关;其他3个ESTs序列与鸡己有核酸数据库中的cDNA克隆或EST具有较高相似性,可认为是鸡的新EST序列,但其功能未知。利用半定量RT-PCR检测SST01、SST04和SST05的EST序列的,发现这些ESTs表达的上调与贮精腺贮精能力增强有关,但这些ESTs的全序列信息及其功能以及作用方式还不清楚,这些都有待今后进一步的研究。通过本实验的实施,可以从基因水平上对贮精腺贮精能力的遗传基础进行研究,为进一步研究确定贮精腺的贮精机理提供重要的信息,也为新扬州鸡品质特性的研究探索了一种新的方法和思路。对于各表达序列标签及其代表的基因在染色体上的精确定位、基因的结构和功能等方面,尚需通过大量分析和实验进行进一步研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 国内外关于贮精腺的研究现状、水平和发展趋势
• 1.1.1 贮精腺的组织结构和细胞组成
• 1.1.2 贮精腺分泌物的成份
• 1.1.3 贮精腺内精子存活时间及空间分布
• 1.2 mRNA 差异显示技术（DDRT-PCR）简介
• 1.2.1 DDRT-PCR 的原理
• 1.2.2 DDRT-PCR 的优点与局限性
• 1.2.3 DDRT-PCR 的应用
• 1.2.4 DDRT-PCR 的发展
• 1.3 半定量RT-PCR 法鉴定差异表达片段
• 1.4 本实验的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验鸡的选择和取样
• 2.1.2 主要药品及试剂的配制
• 2.2 实验方法及步骤
• 2.2.1 组织总RNA 的提取
• 2.2.2 反转录－－cDNA 第一链的获得
• 2.2.3 DDRT-PCR
• 2.2.4 琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.5 凝胶的银染处理
• 2.2.6 差异片段的回收及二次PCR
• 2.2.7 PCR 产物的纯化
• 2法）'>2.2.8 感受态细胞的制备（CaCl₂法）
• 2.2.9 PCR 产物的T 载体连接
• 2.2.10 转化
• 2.2.11 重组质粒的保种和质粒DNA 的小规模提取
• 2.2.12 重组质粒的鉴定
• 2.2.13 半定量检测差异条带在不同处理下的表达
• 2.3 数据统计及分析
• 3 结果与分析
• 3.1 实验鸡受精率的分布
• 3.2 总RNA 样品制备的结果
• 3.3 DDRT-PCR 结果
• 3.4 差异片段回收及二次PCR
• 3.5 差异片段基因克隆、鉴定
• 3.6 差异片段测序及比对
• 3.6.1 SST01 碱基序列及比对结果
• 3.6.2 SST02 碱基序列及比对结果
• 3.6.3 SST03 碱基序列及比对结果
• 3.6.4 SST04 碱基序列及比对结果
• 3.6.5 SST05 碱基序列及比对结果
• 3.6.6 SST06 碱基序列及比对结果
• 3.7 半定量RT-PCR 检测差异条带的表达
• 3.7.1 半定量RT-PCR 条件的优化
• 3.7.2 半定量RT-PCR 结果
• 4 讨论
• 4.1 实验对象的处理和选择
• 4.2 组织总RNA 的提取
• 4.3 反应所用引物的筛选
• 4.4 反应条件对实验结果的影响
• 4.5 剔除假阳性条带
• 4.6 差异序列的生物信息学分析
• 4.6.1 SST01 功能预测
• 4.6.2 SST02 功能预测
• 4.6.3 SST03 功能预测
• 4.6.4 SST04～SST05
• 4.6.5 SST06
• 4.7 差异条带在高低受精率组中表达量差异的生产意义
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文