抗核盘菌芽胞杆菌的筛选鉴定及抗菌物质研究

论文摘要

核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary）是一种世界性分布的重要植物病原真菌,在我国严重威胁油菜生产。利用有益微生物控制核盘菌是目前菌核病防治研究的重点方向。本研究分离到一株对核盘菌有显著拮抗活性的芽胞杆菌X-01菌株,并对其分类地位进行了鉴定、对其拮抗物质进行了分离纯化、对其拮抗物质控制油菜菌核病生防效果进行了评估,结果如下:1.通过对峙培养法,从油菜根际土壤中筛选得到一株对核盘菌有良好拮抗效果的菌株X-01。同时采用形态学观察、生理生化分析、16S rDNA同源性与系统发育分析进行种属鉴定确认菌株X-01为枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）。2.枯草芽胞杆菌X-01发酵液经1 mg/mL的蛋白酶K、胰蛋白酶处理都未见抗菌活性的降低,而且经121℃处理30 min仍有50%的抗菌活性;枯草芽胞杆菌X-01的活性物质能穿过截留分子量为100 kDa的超滤膜,却被截留分子量为30 kDa的膜截留,但向发酵液中加入终浓度50%为甲醇后,活性物质能穿过截留分子量为30 kDa的超滤膜,推测枯草芽胞杆菌X-01所产的拮抗物质属于脂肽类抗生素。3.结合超滤、固相萃取、高效液相色谱对枯草芽胞杆菌X-01的抗菌活性物质进行了分离纯化。基质辅助激光诱导解吸附电离飞行时间质谱分析显示活性物质的分子量为1042.9 Da,用电喷雾电离并结合碰撞活化解离质谱技术进一步确定活性物质的一级结构为Pro-Asn-Ser-βAA-Asn-Tyr-Asn-Gln（βAA为14个碳原子的氨基脂肪酸）,属脂肽类抗生素伊枯草菌素A2（iturin A2）。4.经离体叶片测试,枯草芽胞杆菌X-01抗菌活性物质浓度为100μg/mL时对油菜菌核病的防治效果达100%,10μg/mL时的防治效果仍有40.7%。5.通过显微观察,被枯草芽胞杆菌X-01抗菌活性物质作用后的核盘菌菌丝畸形,原生质凝结,细胞壁穿孔,致使胞内物外溢,菌体最后发生死亡。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1 油菜菌核病的危害及防治
• 1.1 油菜菌核病的危害
• 1.2 核盘菌的致病机理
• 1.3 油菜菌核病的防治
• 2 芽胞杆菌产生的抗菌物质
• 2.1 核糖体途径合成的蛋白质
• 2.1.1 细菌素
• 2.1.2 细胞壁降解酶类
• 2.1.3 其他抗菌蛋白
• 2.2 非核糖体途径合成的脂肽类抗生素
• 2.2.1 脂肽类抗生素的结构
• 2.2.2 脂肽类抗生素的应用功能
• 2.2.2.1 抗病毒作用
• 2.2.2.2 防治植物病原菌
• 2.2.2.3 除去污染土壤的重金属离子和降解有害农药
• 2.2.2.4 微生物采油
• 2.2.2.5 发泡和乳化性能
• 2.2.3 脂肽类抗生素的生理功能
• 2.2.4 脂肽类抗生素的抗菌机制
• 3 研究目的和意义
• 第二章 抗核盘菌芽胞杆菌的筛选鉴定及抗菌物质研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 实验药品和仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 菌株的分离
• 1.2.2 拮抗菌株的筛选
• 1.2.3 拮抗菌株的常规鉴定
• 1.2.4 拮抗菌株的分子辅助鉴定
• 1.2.5 枯草芽胞杆菌X-01发酵液的制备
• 1.2.6 抗菌活性的测定
• 1.2.7 拮抗菌株的抗菌谱分析
• 1.2.8 菌株X-01发酵液稳定性研究
• 1.2.9 拮抗物质的分离纯化
• 1.2.9.1 超滤浓缩拮抗物质
• 1.2.9.2 固相萃取分离拮抗物质
• 1.2.9.3 高效液相色谱分离拮抗物质
• 1.2.10 拮抗物质的结构鉴定
• 1.2.10.1 分子量测定
• 1.2.10.2 一级结构分析
• 1.2.11 纯化的抗菌物质对油菜菌核病的离体防治实验
• 1.2.12 菌株X-01拮抗物质抗真菌机理初步研究
• 3 结果
• 3.1 拮抗菌株的筛选
• 3.2 菌株X-01的形态特征和生理生化反应
• 3.3 芽胞杆菌X-01的分子鉴定
• 3.3.1 芽胞杆菌X-01 16S rDNA的PCR扩增结果
• 3.3.2 芽胞杆菌X-01的16S rDNA序列分析
• 3.4 枯草芽胞杆菌X-01的抗菌谱
• 3.5 枯草芽胞杆菌X-01发酵液的稳定性
• 3.5.1 温度对拮抗活性的影响
• 3.5.2 pH值对拮抗活性的影响
• 3.5.3 蛋白酶对拮抗活性的影响
• 3.5.4 有机溶剂对拮抗活性的影响
• 3.5.5 紫外线对拮抗活性的影响
• 3.5.6 甲醇对菌株X-01拮抗物质聚集特性的影响
• 3.6 枯草芽胞杆菌X-01拮抗物质的分离
• 3.6.1 固相萃取分离菌株X-01的拮抗物质
• 3.6.2 高效液相色谱分离菌株X-01拮抗物质
• 3.7 拮抗物质的分子量
• 3.8 拮抗物质的一级结构分析
• 3.9 枯草芽胞杆菌X-01拮抗物质对油菜菌核病的离体防治效果
• 3.10 枯草芽胞杆菌X-01拮抗物质抗真菌机理
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 硕士在读期间申请的专利和（待）发表论文